ステージ固有の半ばから後半のユーティリティ<em>ショウジョウバエ</em>卵胞の分離
Summary
半ばから後半ショウジョウバエ濾胞の段階特異的分離は、様々な目的に有用である。このような卵胞は、in vitroの開発アッセイとライブイメージングと結合される遺伝的および/ または薬理学的な操作を可能にする、文化の中で開発しています。さらに、毛包には、mRNAおよびタンパク質を単離するなどの分子的研究のために使用することができる。
Abstract
ショウジョウバエの卵形成または卵胞の発達が広く複雑な発達および細胞生物学的過程の理解を進めるために使用されている。この方法は紙は半ばから後期の卵胞（ステージ10B-14）を単離及び発達時間のタイトな窓の間に発生する分子および形態学的事象に新たな洞察を提供するために、それらを利用する方法について説明します。単離された毛包は、in vitroアッセイを開発、ライブイメージング、mRNA発現解析およびタンパク質のウェスタンブロット分析を含む実験技術、様々に使用することができる。卵胞期10B（S10B）で以降は文化の中で、開発を完了し、これは1、開発の特定の期間中に発生したプロセスに対するそのような操作の影響を定義するためのin vitro開発に遺伝的または薬理学的摂動を組み合わせることができます。これらの卵胞は文化の中で発展されるためさらに、それらは、理想的にライブイメージング研究に適しています、多くの場合、形態学的事象を仲介する新しいメカニズムを明らかにした。単離された毛包はまた、分子分析のために使用することができる。例えば、遺伝子の摂動から生じる遺伝子発現の変化は、特定の発達のウィンドウのために定義することができる。さらに、タンパク質レベル、安定性、および/または卵胞発育の特定の段階の間に翻訳後修飾の状態は、ウェスタンブロット解析を介して検査することができる。このように、 ショウジョウバエ包の段階特異的分離は、開発と形態形成の広く保存プロセスに豊富な情報源を提供しています。
Introduction
各ショウジョウバエ卵巣は〜16 ovarioles、または連続して卵室や卵胞を成熟の鎖から構成されている。各卵胞が単一の卵母細胞、15生殖系列に由来する看護師やサポート細胞、および濾胞細胞（ 図1A）と呼ばれる〜650体細胞で構成されている。 ショウジョウバエの卵形成は、開発1の14形態学的に定義されている段階に分けられる。卵胞の各発達段階は、それが比較的容易段階特異卵胞の実質的な数を単離すること、単一のフライ内で何度も観察される。
卵形成（ステージ10B-14）の半ばから後半のステージは、ステージの分離（ 図1）に特に適している。ステージ10B（S10B）では、毛包が完全に伸長される（ すなわち、その長さは、ステージ14のそれと等しい（S14）卵胞、 図1と図2Hを参照）、卵胞の半分の長さは、ナース細胞から構成されている他の半分は、卵母細胞（ 図1C）であり、一方。この段階では、看護師の細胞は、皮質アクチンを強化し、アクチンフィラメント2の並列バンドルを生成し、劇的なアクチンリモデリングを受ける。同時に、毛包細胞の集団は、求心性細胞と呼ばれる、背側付属物を形成するために、移行を受けるために指定なっナース細胞および卵母細胞および卵胞セルの2つの背側基との間で移行する、胚、3管状の呼吸装置。それは胚発生（ 図1D）を完了するために必要な要因と卵母細胞を提供し、看護師のセルはダンプと呼ばれるプロセスに卵母細胞にそれらの細胞質の内容を絞るナース細胞その後契約（S11）。ナース細胞は、次いで、細胞死（S12-S13）4を受け、卵胞細胞が卵殻5（ 図1E-G）を分泌し、パターン。このように、卵形成の終わりには、重要な発達ANと豊富であるD形態形成のプロセス。
単離された半ばから後期の卵胞（S10B-S14）は、分子分析など、さまざまな目的に使用することができる。例えば、段階的な卵胞からのmRNAは、RT-PCR、マイクロアレイのために単離することができ、又はRNA-seqの分析。これは1が存在する少数の細胞型と、短い発達ウィンドウ内の遺伝子発現を調べ、遺伝子発現を薬理学的または遺伝のどちらかの摂動によってどのように変化するかを決定することができます。ステージの分離もウェスタンブロッティングによってタンパク質を調べるために使用することができます。それは一つの特定の段階での突然変異体対野生型タンパク質の発現レベルを定量することを可能にするので、そのような分析は重要である。一つは免疫蛍光は、同様の結果を達成するために分析を使用できるが、蛍光の定量化は、全ての画素が検出6の線形範囲内である厳密な要件によりロバストである。さらに、ウェスタンブロット分析は、他の情報を提供することができるようなSタンパク質が翻訳後修飾されているか、特定のスプライスアイソフォームから発現されている場合。単離されたステージはまた、細胞下分画または免疫沈降を含むさらなるタンパク質精製のために使用することができる。
段階特異的な卵胞の分離はまた、 インビトロのアッセイの開発7および8ライブイメージングのために使用することができる。孤立S10B-S13包（下記参照）の単純な培養培地中で、S14に開発していきます。これは、S10A包が看護セルは、この原稿で説明した培養条件を使用してダンプを経て進行しないことに注意することは重要である。我々はリードアウト7,9として看護師電池投棄や開発を使用することにより、アクチンリモデリングを調節する上で、両方の薬理学的および遺伝学的に、プロスタグランジンの役割を定義するためにS10B のin vitroアッセイの開発を使用している。同様に、発達の後期段階はまた、薬理学的治療または遺伝子人間の効果を決定するために、単離することができるこのような求心細胞移動、背側付属器の移行/形成10、看護師の細胞死のような特定のプロセスに関するipulations。このようなアッセイは、支配的な相互作用スクリーニングまたはアッセイを実行するために使用することができ、例えば、単独でPXTにおける突然変異のためにヘテロ接合性またはファシンは S10B インビトロ発達に影響を及ぼさないが、二重ヘテロ接合展示看護欠陥をダンプ細胞および現像9のブロックからの卵胞。
S10B-13培養で開発することができるので、さらに、この時間の間に発生するすべてのプロセスは、ライブイメージングによって観察することができる。そのような画像は、透過光（一方は形態の総変化にのみ関心がある場合）またはライブ画像形成色素で染色し、蛍光プローブ又は卵胞を発現するトランスジェニックハエを用いて共焦点顕微鏡とを使用して簡単に行うことができる。ライブイメージングは、実質的に発達過程の理解を進めるために使用されている。実際、ライブイマジン後期包のGは、背側付属器の移行、細管形成10の例の知識を拡大してきました。私たちは、看護師細胞中のアクチン動態を含む追加の後期過程のライブイメージング、ダンピングは、これらの発生事象に新たな洞察を提供することを期待しています。それは、S10Aと卵胞の発達の初期段階は、文化の中で、S14へと発展していきませんが、開発のそれらのステージ中に発生するイベントのライブイメージング（詳細のための議論を参照して、代替の培養条件を11から14を使用して可能であることに注意することが重要です情報）。
ここでは、in vitroでの開発やライブ映像、または分子解析（mRNAおよびタンパク質の分離）のいずれかのために後期包を単離するための詳細なプロトコルを提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ショウジョウバエの卵胞は形態学的および分子解析の両方に最適です、細胞種の数が少ないから構成されている。さらに、卵巣の構造に起因し、それは一般的な解剖範囲および最小のトレーニングで卵胞発育の特定の段階を大量に得ることは比較的容易である。各ステージは短い時間窓を表すように、ステージの分離は、そのステージ中に発生する発生過程に重要な分子の洞察を提供…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、試薬についてトーマスLecuit（SQH-ユートロフィン:: GFPライン ）、ブルーミントンストックセンター、発達研究ハイブリドーマバンクに感謝したいと思います。我々はさらに、原稿の有用な議論や批判のためにゆっくり吹き続けるラボのすべてのメンバーに感謝します。国立科学財団MCB-1158527からの資金調達、および解剖学と細胞生物学部門の立ち上げ資金、アイオワ大学は、この作品を支持した。薬理学T32GM067795保健博士号を取得する前のトレーニンググラントの国立研究所は、AJSを支持した。データ·ストレージのサポートは研究資源のための国民の中心とグラントUL1RR024979した翻訳科学、国立衛生研究所を進めるためのナショナルセンターでサポートされているCTSAを通じて資金を供給されるICTS、提供された。
Materials
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | Any source of Active Dry Yeast is fine |
| Grace’s Insect Media | Lonza | 04-457F | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | Any Heat Inactivated FBS should work |
| 10x Pen/Strep | Gibco/Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises and Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Spot Plate, Nine Well | Corning | 7220-85 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 24 multi-well plates | Becton Dickinson | 35 3226 | Any 24-well tissue culture dish should work |
| Coverslip Bottom Dishes (35mm) | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used |
| Glass pipettes | Corning | 7095B-5x (for transferring follicles) | |
| Glass pipettes – long | Corning | 7095B-9 (for producing pulled pipettes) | |
| Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free) | Research Products International | 199228 | Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
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