L'utilità della fase-specifici medio-tardiva<em> Drosophila</em> Follicolo isolamento

Summary

Stadio-specifica isolamento di medio-tardiva follicoli Drosophila è utile per una varietà di scopi. Tali follicoli si sviluppano nella cultura, che permette di manipolazioni genetiche e / o farmacologici per essere accoppiato con saggi in vitro di sviluppo e immagini dal vivo. Inoltre, follicoli possono essere usate per studi molecolari, come isolare mRNA e proteine.

Abstract

Drosophila oogenesi o lo sviluppo del follicolo è stato ampiamente utilizzato per far progredire la comprensione dei complessi processi biologici di sviluppo e cellulari. Questo documento descrive i metodi come isolare medio-tardiva follicoli fase (fase 10B-14) e di utilizzarle per fornire nuove intuizioni gli eventi molecolari e morfologiche che si verificano durante le finestre strette di tempo di sviluppo. Isolato follicoli possono essere utilizzati per una varietà di tecniche sperimentali, inclusi vitro nello sviluppo, l'imaging dal vivo, analisi di espressione di mRNA e analisi western blot di proteine. Follicoli dello Stage 10B (S10B) o poi completare lo sviluppo in coltura, questo permette di coniugare perturbazioni genetiche o farmacologiche con lo sviluppo in vitro per definire gli effetti di tali manipolazioni sui processi che si verificano durante periodi specifici dello sviluppo. Inoltre, poiché questi follicoli si sviluppano nella cultura, sono l'ideale per gli studi di imaging dal vivo, Che spesso rivelare nuovi meccanismi che mediano eventi morfologici. Isolato follicoli possono essere utilizzati anche per analisi molecolari. Per esempio, cambiamenti nell'espressione genica che derivano da perturbazioni genetiche possono essere definiti per specifiche finestre di sviluppo. Inoltre, livello di proteine, stabilità, e / o stato modificazione post-traslazionale durante una particolare fase di sviluppo del follicolo possono essere esaminati mediante analisi Western blot. Pertanto, l'isolamento specifico stadio di follicoli Drosophila fornisce una ricca fonte di informazioni in processi ampiamente conservate di sviluppo e morfogenesi.

Introduction

Ogni ovaio Drosophila è composto di ~ 16 ovarioli, o catene di sequenza maturazione camere di uova o follicoli. Ogni follicolo è costituito da un unico ovocita, derivate cellule nutrici o di sostegno 15 della linea germinale, e ~ 650 cellule somatiche chiamati cellule follicolari (Figura 1A). Drosophila oogenesi è diviso in 14 tappe morfologicamente definiti di sviluppo ^1. Ogni stadio di sviluppo follicolare è osservato più volte all'interno di una singola mosca, rendendo relativamente facile isolare un consistente numero di follicoli stadio-specifica.

Medio-tardiva Le tappe di dell'ovogenesi (Tappe 10B-14) sono particolarmente adatti per l'isolamento stadio (Figura 1). Nella Fase 10B (S10B), il follicolo è completamente allungata (cioè la sua lunghezza è pari a quella di uno Stage 14 (S14) follicolo, vedi Figura 1 e Figura 2H) e metà della lunghezza del follicolo è composto da cellule infermierementre l'altra metà è l'ovocita (Figura 1C). In questa fase le cellule nutrici subiscono drammatico rimodellamento actina, il rafforzamento del actina corticale e la generazione di fasci paralleli di filamenti di actina ^2. Allo stesso tempo, una popolazione di cellule del follicolo, chiamato cellule centripete, migrare tra le cellule infermiere e l'ovocita, e due gruppi di cellule follicolari dorsali diventa specificato sottoporsi migrazione per formare le appendici dorsali, apparecchi respiratori tubolari per l'embrione ³ . Le cellule nutrici poi contrattuali (S11), spremere il loro contenuto citoplasmatico nell'ovocita in un processo chiamato cella di infermiere dumping, che fornisce l'ovocita con i fattori necessari per poter completare l'embriogenesi (Figura 1D). Le cellule vengono poi sottoposte infermiere morte cellulare (S12-S13) ^4, e le cellule follicolari secernono e modello del guscio ⁵ (Figure 1E-G). Così, alla fine dell'oogenesi è ricca di un importante sviluppod processi morfogenetici.

Isolato follicoli medio-fase recente (S10B-S14) possono essere utilizzati per una varietà di scopi, comprese le analisi molecolari. Ad esempio, mRNA da follicoli in scena può essere isolato per RT-PCR, microarray, o analisi RNA-seq. Questo permette di guardare l'espressione genica in un breve lasso di sviluppo, con solo pochi tipi di cellule presenti, e determinare come l'espressione genica è cambiato da perturbazioni sia farmacologici o genetici. Isolamento fase può anche essere usato per guardare proteine ​​mediante western blotting. Tale analisi è importante perché permette di quantificare il livello di espressione della proteina in wild-type contro mutanti nelle fasi specifiche. Sebbene si possa usare immunofluorescenza analisi per ottenere risultati simili, quantificazione della fluorescenza è meno robusta a causa dei requisiti rigorosi che tutti i pixel essere compresa nell'intervallo lineare di rilevamento ^6. Inoltre, l'analisi western blot può fornire altre informazioni, ad uns se la proteina viene posttranslationally modificato o è espressa da una specifica isoforma di splicing. Isolato fasi possono anche essere usati per ulteriore purificazione della proteina, compreso frazionamento subcellulare o coimmunoprecipitation.

Specifica fase di isolamento follicolo può essere utilizzato anche per saggi in vitro per lo sviluppo ⁷ e dal vivo-imaging ^8. Isolato follicoli S10B-S13 continuerà a sviluppare per S14 in semplice terreni di coltura (vedi sotto). È importante notare che i follicoli S10A non progredire attraverso cella infermiera scarico utilizzando le condizioni di coltura discusse in questo manoscritto. Abbiamo usato S10B vitro di sviluppo nel definire il ruolo delle prostaglandine, sia farmacologicamente e geneticamente, nella regolazione actina rimodellamento utilizzando cellule infermiere dumping e di sviluppo che il read-out ^7,9. Analogamente, le successive fasi di sviluppo possono essere isolati per determinare gli effetti dei trattamenti farmacologici o uomo geneticaipulations su particolari processi come la migrazione centripeta delle cellule, la migrazione appendice dorsale / ¹⁰ la formazione, e la morte cellulare infermiere. Tali saggi possono essere utilizzati per eseguire le schermate di interazione dominanti o saggi, ad esempio, mentre eterozigosi per mutazioni nel pxt o fascina da soli non hanno alcun effetto sulla S10B sviluppo in vitro, follicoli dei doppi eterozigoti cella infermiera mostra il dumping difetti e un blocco nello sviluppo ^9.

Inoltre, poiché S10B-13 può svilupparsi nella cultura, tutti i processi che si verificano durante questo periodo può essere osservato da live-imaging. Tale rappresentazione può essere eseguita semplicemente utilizzando luce trasmessa (se si è interessati solo a cambiamenti lordi in morfologia) o con la microscopia confocale utilizzando mosche transgeniche esprimenti sonde fluorescenti o follicoli colorati con coloranti di imaging dal vivo. L'imaging dal vivo viene utilizzato per far avanzare notevolmente la nostra comprensione dei processi di sviluppo. Infatti, vivere imaging di follicoli in fase avanzata ha ampliato la conoscenza della migrazione appendice dorsale, un esempio di tubulogenesi ^10. Ci aspettiamo che l'imaging dal vivo di ulteriori processi tardivamente, comprese le dinamiche di actina durante la cella infermiere di dumping, fornirà nuove intuizioni in questi eventi evolutivi. E 'importante notare che mentre S10A e prime fasi di sviluppo del follicolo non continueranno a svilupparsi in un S14 in cultura, live-imaging di eventi che si verificano durante queste fasi di sviluppo è possibile utilizzando condizioni di coltura alternativi ^11-14 (vedi la discussione per ulteriori informazioni).

Qui forniamo protocolli dettagliati per isolare i follicoli in fase avanzata sia per lo sviluppo in vitro e viviamo-imaging, o analisi molecolari (mRNA e isolamento proteine).

Protocol

1. Preparazione Drosophila Prima di stage isolamento Rendere lievito in pasta umida combinando 50 g di lievito secco con 90 ml di acqua distillata. Mescolare con una spatola per unire. Lasciare riposare l'impasto per ~ 30 minuti prima di valutare la coerenza. La consistenza dovrebbe essere abbastanza spesso per aderire al lato di un flaconcino mosca ma non correre lungo il lato. Per ottenere la consistenza desiderata può essere necessario aggiungere fino a 10 ml di acqua aggiuntiva o una piccola…

Representative Results

Quando si isola specifici stadi di sviluppo del follicolo Drosophila è essenziale essere in grado di distinguere con precisione le diverse fasi morfologiche. Questo è piuttosto impegnativa per S10A e S10B, come le cellule infermiere e l'ovocita ognuna metà della lunghezza del follicolo in queste fasi (Figura 1B rispetto a 1C). Tuttavia, follicoli S10A sono più corta follicoli S10B, come i follicoli S10B sono completamente allungati e quindi di lunghezza pari ad un folli…

Discussion

Il follicolo Drosophila è composto da un piccolo numero di tipi cellulari, rendendolo ideale sia morfologica e analisi molecolari. Inoltre, a causa della struttura dell'ovaio, è relativamente facile ottenere un gran numero di stadi specifici dello sviluppo del follicolo con un ambito dissezione comune e una formazione minima. Come ogni tappa rappresenta una breve finestra temporale, isolamento stadio può offrire notevoli spunti molecolari nei processi di sviluppo che si verificano durante tale fase. Ad e…

Materials

Active Dry Yeast	Genesee Scientific	62-103	Any source of Active Dry Yeast is fine
Grace’s Insect Media	Lonza	04-457F
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11050H	Any Heat Inactivated FBS should work
10x Pen/Strep	Gibco/Invitrogen	15140-122
Pin Vises and Needles	Ted Pella, Inc.	13561-10
Spot Plate, Nine Well	Corning	7220-85
#5 Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-20
24 multi-well plates	Becton Dickinson	35 3226	Any 24-well tissue culture dish should work
Coverslip Bottom Dishes (35mm)	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used
Glass pipettes	Corning	7095B-5x (for transferring follicles)
Glass pipettes – long	Corning	7095B-9 (for producing pulled pipettes)
Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free)	Research Products International	199228	Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used
Trizol	Invitrogen	15596-018