Das Utility von Stage-spezifischen Mid-zu-spät<em> Drosophila</em> Follikel Isolation
Summary
Stufe spezifischen Isolierung von mittleren bis späten Drosophila Follikel ist nützlich für eine Vielzahl von Zwecken. Wie Follikel in Kultur, die für die genetische und / oder pharmakologischen Manipulationen in vitro-Assays und Entwicklung die Bildgebung gekoppelt werden können. Zusätzlich kann Follikel für molekularbiologische Untersuchungen, wie Isolierung von mRNA und Protein verwendet werden.
Abstract
Drosophila Oogenese oder Follikel-Entwicklung wurde häufig verwendet, um das Verständnis für komplexe Entwicklungsprozesse und Zell biologischen voranzutreiben. Das Methodenpapier beschrieben, wie Sie mittleren bis späten Stadium Follikel (Stufe 10B-14) zu isolieren und zu nutzen, um neue Einblicke in die molekularen und morphologischen Ereignisse während dichte Fenster der Entwicklungs Zeit auftreten werden. Isolierte Haarfollikel kann für eine Vielzahl von experimentellen Techniken, einschließlich in vitro-Assays Entwicklung, Echtzeit-Bildgebung, mRNA-Analyse und Western-Blot-Analyse von Proteinen verwendet werden. Follikel bei Stage 10B (S10B) oder später wird die Entwicklung in Kultur zu vervollständigen, dies erlaubt es, genetische oder pharmakologische Störungen mit in-vitro-Entwicklung zu kombinieren, um die Auswirkungen dieser Manipulationen auf die Prozesse zu bestimmten Zeiten auftretenden Entwicklung zu definieren. Darüber hinaus, da diese Follikel entwickeln, in der Kultur, sind sie ideal für Live-Imaging-Studien geeignet sind, Die oft zeigen neue Mechanismen, die morphologische Ereignisse zu vermitteln. Isoliert Follikel kann auch für molekulare Analysen verwendet werden. Zum Beispiel können Veränderungen in der Genexpression, die von genetischen Störungen führen zu spezifischen Entwicklungs Fenster definiert werden. Zusätzlich können Protein-Ebene, die Stabilität und / oder posttranslationale Modifikation Zustand während einer bestimmten Stufe der Follikelentwicklung durch Western-Blot-Analysen untersucht werden. So Stufe spezifischen Isolierung von Drosophila Follikel bietet eine reiche Quelle von Informationen in stark konservierten Prozesse der Entwicklung und Morphogenese.
Introduction
Jeder Drosophila Eierstock von ~ 16 Ovariolen oder Ketten von sequentiell Reifekammern oder-Ei Follikel zusammen. Jeder Follikel besteht aus einer einzigen Eizelle, 15 Keimbahn abgeleitet Krankenschwester oder Stützzellen und ~ 650 somatischen Zellen bezeichnet Follikel-Zellen (Abbildung 1A) zusammen. Wird Drosophila Oogenese in 14 morphologisch definierten Entwicklungsstufen 1 unterteilt. Jedes Stadium der Follikelentwicklung wird viele Male innerhalb einer Fliege beobachtet, so dass es relativ einfach, eine beträchtliche Anzahl von stufenspezifischen Follikel zu isolieren.
Die mittleren bis späten Stadien der Oogenese (Stages 10B-14) sind besonders gut geeignet für die Bühne Trennung (Abbildung 1). In Stufe 10B (S10B) wird das Follikel vollständig gestreckt (dh gleich dem eines Stage-14 (S14) Follikel seine Länge, siehe Abbildung 1 und Abbildung 2 H) und die Hälfte der Länge der Follikel der Krankenschwester Zellen zusammengesetztdie andere Hälfte ist die Eizelle (Abbildung 1C). In diesem Stadium die Krankenschwester Zellen durchlaufen dramatischen Aktin-Umbau, die Stärkung der kortikalen Aktin und Erzeugung parallelen Bündeln von Aktin-Filamenten 2. Zur gleichen Zeit, eine Bevölkerung von Follikel-Zellen, genannt zentripetalen Zellen wandern zwischen den Nährzellen und der Eizelle und zwei Rücken Gruppen von Follikelzellen angegebenen geworden, Migration zu unterziehen, um die Rückenanhänge, Röhrenatemgeräten für den Embryo bilden 3 . Die Zellen werden dann Krankenschwester Vertrag (S11), drückte ihre zytoplasmatische Inhalt in die Eizelle in einem Prozess namens Krankenschwester Zelle Dumping, das die Eizelle bietet mit den notwendigen Faktoren für sie Embryogenese (1D), um abzuschließen. Die Krankenschwester Zellen durchlaufen dann den Zelltod (S12-S13) 4, und die Follikel-Zellen sezernieren und die Eierschale Muster 5 (1E-G). So reich an wichtigen Entwicklungs eine ist das Ende der Oogenesed morphogenetischen Prozessen.
Isoliert mittleren bis späten Stadium Follikel (S10B, S14) für eine Vielzahl von Zwecken, einschließlich der molekularen Analysen verwendet werden. Beispielsweise kann mRNA aus statt Follikel für RT-PCR, Microarray isoliert werden oder RNA-seq analysiert. Dies erlaubt es, bei der Genexpression in kurzer Entwicklungs Fenster schauen, mit nur wenigen Zelltypen vorhanden, und bestimmen, wie die Genexpression entweder durch pharmakologische oder genetische Störungen verändert. Stufe Isolierung kann auch verwendet werden, um auf Proteine durch Western-Blotting zu suchen. Eine solche Analyse ist wichtig, weil es erlaubt, die Höhe der Proteinexpression in Wildtyp-Mutanten gegenüber in bestimmten Phasen zu quantifizieren. Während einer Immunfluoreszenzanalysen verwenden, um ähnliche Ergebnisse zu erzielen, die Quantifizierung der Fluoreszenz weniger robust ist aufgrund der strengen Anforderungen, die alle Pixel innerhalb des linearen Bereichs des Nachweises 6 sein. Zusätzlich können Western-Blot-Analyse von anderen Informationen, wie eins, wenn das Protein posttranslational modifiziert oder von einer bestimmten Spleiß-Isoform exprimiert. Isoliert Stufen können auch für weitere Proteinreinigung, einschließlich subzelluläre Fraktionierung oder Coimmunpräzipitation verwendet werden.
Stufe spezifischen Follikel Isolierung kann auch für die in vitro Entwicklung Assays 7 und Live-Abbildungs 8 verwendet werden. Isoliert S10B-S13 Follikel wird weiterhin auf S14 in einfachen Kulturmedien zu entwickeln (siehe unten). Es ist wichtig zu beachten, dass S10A Follikel nicht durch Dumping Krankenschwester Zelle mit Hilfe der Kulturbedingungen in diesem Manuskript diskutiert Fortschritte. Wir haben S10B in-vitro-Tests zur Entwicklung der Rolle der Prostaglandine sowohl pharmakologisch und genetisch zu definieren, bei der Regulierung der Aktin-Umbau durch die Verwendung Krankenschwester Zelle Dumping und Entwicklung Auslesen 7,9. Ebenso können die späteren Entwicklungsstadien isoliert werden, um die Wirkungen von pharmakologischen Behandlungen oder genetische Menschen bestimmenipulations auf bestimmte Prozesse wie zentripetale Zellmigration, Rücken Anhängsel Migration / Bildung 10 und Krankenschwester Zelltod. Solche Tests können verwendet werden, um dominante Wechselwirkung Bildschirmen oder Tests durchzuführen, zum Beispiel, während Heterozygotie für Mutationen in pxt oder Fascin allein haben keine Auswirkungen auf S10B in vitro Entwicklung von Follikeln Doppel Heterozygoten zeigen Krankenschwester Zelle Dumping Fehler und ein Block in der Entwicklung 9.
Darüber hinaus, da S10B-13 in Kultur entwickeln, werden alle Prozesse, die während dieser Zeit auftreten kann mit Live-Bildgebung beobachtet werden. Solche Bildgebung kann einfach mit Durchlicht (wenn man nur daran interessiert, große Änderungen in der Morphologie ist) oder mit der konfokalen Mikroskopie mit transgenen Fliegen exprimieren Fluoreszenzsonden oder Follikel mit Live-Bildfarbstoffe gefärbt durchgeführt werden. Live-Bildgebung verwendet wird, um unser Verständnis der Entwicklungsprozesse wesentlich voranzubringen. Tatsächlich leben imaging spät Follikel hat das Wissen der dorsalen Anhängsel Migration, ein Beispiel Tubulogenese 10 erweitert. Wir erwarten, dass die Live-Darstellung von zusätzlichen späten Stadium Prozesse, einschließlich der Aktin-Dynamik während Krankenschwester Zelle Dumping, werden neue Einblicke in diesen Entwicklungs Veranstaltungen. Es ist wichtig zu beachten, dass während S10A und frühen Stadien der Follikel-Entwicklung wird nicht weiter in der Kultur in eine S14 zu entwickeln, ist Live-Imaging von Veranstaltungen in diesen Stadien der Entwicklung auftreten können, die alternative Kulturbedingungen 11-14 (siehe Diskussion für mehr Information).
Hier bieten wir Ihnen ausführliche Protokolle zur Isolierung spät Follikel entweder für in-vitro-Entwicklung und Live-Bildgebung, oder molekulare Analysen (mRNA-und Protein-Trennung).
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Drosophila Follikel von nur einer kleinen Anzahl von Zelltypen aufgebaut, so dass es ideal für morphologische und molekulare Analysen. Außerdem ist es aufgrund der Struktur des Eierstocks, ist es relativ einfach, eine große Zahl von spezifischen Stadien der Follikel-Entwicklung mit einem gemeinsamen Binokular und minimales Training erhalten. Wie jede Stufe stellt eine kurze Zeitfenster, können Stufen-Isolations signifikante Einblicke in die molekularen Entwicklungsprozesse während dieser Phase auftrete…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Thomas Lecuit (SQH Utrophin :: GFP-Linie), die Bloomington Stock Center, und der Entwicklungsforschung Hybridoma Bank für Reagenzien danken. Wir danken ferner alle Mitglieder der Tootle Lab für hilfreiche Diskussionen und Kritiken des Manuskripts. Finanzierung durch die National Science Foundation MCB-1158527 und Start-up-Fonds aus der Anatomie und Zellbiologie Department, University of Iowa unterstützt diese Arbeit. National Institutes of Health Predoctoral Ausbildungsförderung in Pharmakologische Wissenschaften T32GM067795 AJS unterstützt. Datenspeicherung Unterstützung wurde von der ICTS, die durch die CTSA vom National Center for Research Resources und dem National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, unterstützt durch Zuschuss UL1RR024979 finanziert wird.
Materials
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | Any source of Active Dry Yeast is fine |
| Grace’s Insect Media | Lonza | 04-457F | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | Any Heat Inactivated FBS should work |
| 10x Pen/Strep | Gibco/Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises and Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Spot Plate, Nine Well | Corning | 7220-85 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 24 multi-well plates | Becton Dickinson | 35 3226 | Any 24-well tissue culture dish should work |
| Coverslip Bottom Dishes (35mm) | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used |
| Glass pipettes | Corning | 7095B-5x (for transferring follicles) | |
| Glass pipettes – long | Corning | 7095B-9 (for producing pulled pipettes) | |
| Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free) | Research Products International | 199228 | Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
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