की उपयोगिता स्टेज विशिष्ट मध्य से देर से<em> ड्रोसोफिला</em> कूप अलगाव
Summary
मध्य से देर ड्रोसोफिला रोम के स्टेज विशिष्ट अलगाव विभिन्न प्रयोजनों के लिए उपयोगी है. इस तरह के रोम में इन विट्रो विकास assays और लाइव इमेजिंग के साथ मिलकर किया जा करने के लिए आनुवंशिक और / या pharmacologic जोड़तोड़ के लिए अनुमति देता है जो संस्कृति में विकसित करना. इसके अतिरिक्त, रोम ऐसी mRNA और प्रोटीन को अलग रूप में आणविक पढ़ाई के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
ड्रोसोफिला oogenesis या कूप विकास व्यापक रूप से जटिल विकासात्मक और सेल जीवविज्ञान प्रक्रियाओं की समझ अग्रिम करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. यह तरीकों कागज मध्य से देर से मंच के रोम (स्टेज 10B-14) को अलग करने और विकासात्मक समय की तंग खिड़कियों के दौरान होने वाली आणविक और शब्द के भागों की घटनाओं में नए अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए उन्हें का उपयोग कैसे करें. पृथक रोम में इन विट्रो विकास assays, लाइव इमेजिंग, mRNA अभिव्यक्ति विश्लेषण और प्रोटीन के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण सहित प्रयोगात्मक तकनीकों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. स्टेज 10B (S10B) पर या बाद में रोम संस्कृति में विकास पूरा हो जाएगा, यह एक विकास के विशिष्ट अवधि के दौरान होने वाली प्रक्रियाओं पर इस तरह के जोड़तोड़ के प्रभाव को परिभाषित करने के लिए इन विट्रो विकास के साथ आनुवंशिक या pharmacologic perturbations गठबंधन करने की अनुमति देता है. इन रोम संस्कृति में विकसित क्योंकि इसके साथ ही, वे आदर्श लाइव इमेजिंग अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं, अक्सर रूपात्मक घटनाओं मध्यस्थता कि नया तंत्र प्रकट जो. पृथक रोम भी आणविक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, आनुवंशिक perturbations से परिणाम है कि जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन विशिष्ट विकासात्मक खिड़कियों के लिए परिभाषित किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, कूप विकास के एक विशेष चरण के दौरान प्रोटीन के स्तर, स्थिरता, और / या posttranslational संशोधन राज्य वेस्टर्न ब्लॉट के माध्यम से विश्लेषण करती है की जांच की जा सकती है. इस प्रकार, ड्रोसोफिला रोम के मंच विशिष्ट अलगाव विकास और morphogenesis का व्यापक रूप से संरक्षित प्रक्रियाओं में जानकारी का एक समृद्ध स्रोत प्रदान करता है.
Introduction
प्रत्येक ड्रोसोफिला अंडाशय 16 ovarioles, या क्रमिक रूप से परिपक्व अंडा कक्षों या रोम की चेन ~ से बना है. प्रत्येक कूप एक एकल oocyte, 15 रोगाणु लाइन व्युत्पन्न नर्स या समर्थन कोशिकाओं, और कूप कोशिकाओं (चित्रा 1 ए) में कहा ~ 650 दैहिक कोशिकाओं से बना है. ड्रोसोफिला oogenesis विकास 1 की 14 आकृति विज्ञान परिभाषित चरणों में बांटा गया है. कूप विकास के हर चरण में यह अपेक्षाकृत आसान चरण विशिष्ट रोम के एक पर्याप्त संख्या अलग करने के लिए कर रही है, एक मक्खी के भीतर कई बार मनाया जाता है.
oogenesis (10B-14 चरणों) के मध्य से देर चरणों (चित्रा 1) चरण अलगाव के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल है. स्टेज 10B (S10B) में, कूप पूरी तरह से (यानी उसकी लंबाई एक स्टेज 14 (S14) कूप के बराबर है, चित्रा 1 और चित्रा 2H देखें) लम्बी है और कूप की लंबाई आधा नर्स कोशिकाओं से बना हैअन्य आधा oocyte (चित्रा 1C) है. इस स्तर पर नर्स कोशिकाओं cortical actin को मजबूत बनाने और actin filaments 2 के समानांतर बंडलों पैदा करने, नाटकीय actin remodeling गुजरना. इसी समय, कूप कोशिकाओं की आबादी, नर्स कोशिकाओं और oocyte के बीच में विस्थापित, केन्द्राभिमुख कोशिकाओं करार दिया, और कूप कोशिकाओं के दो पृष्ठीय समूहों पृष्ठीय उपांग, भ्रूण 3 के लिए ट्यूबलर सांस apparatuses के लिए फार्म प्रवास गुजरना करने के लिए निर्दिष्ट बनने . नर्स यह embryogenesis (चित्रा -1) को पूरा करने के लिए आवश्यक कारकों के साथ oocyte प्रदान करता है जो नर्स सेल डंपिंग नामक प्रक्रिया में oocyte में उनके cytoplasmic सामग्री फैलाएंगे तो अनुबंध (S11), कोशिकाओं. नर्स कोशिकाओं को फिर कोशिका मृत्यु (S12-S13) 4 से गुजरना है, और कूप कोशिकाओं eggshell 5 (आंकड़े 1E जी) छिपाना और पैटर्न. इस प्रकार, oogenesis के अंत महत्वपूर्ण विकास एक साथ समृद्ध हैडी morphogenetic प्रक्रियाओं.
पृथक मध्य से देर से मंच के रोम (S10B-S14) आणविक विश्लेषण सहित विभिन्न उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, मंचन रोम से mRNA RT-पीसीआर, माइक्रोएरे के लिए अलग किया जा सकता है, या आरएनए seq विश्लेषण करती है. यह एक वर्तमान में केवल कुछ प्रकार की कोशिकाओं के साथ, एक छोटी विकासात्मक खिड़की के भीतर जीन अभिव्यक्ति को देखो, और जीन अभिव्यक्ति pharmacologic या आनुवंशिक या तो perturbations से बदल रहा है कैसे निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है. स्टेज अलगाव भी पश्चिमी सोख्ता द्वारा प्रोटीन को देखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह एक विशिष्ट चरणों में म्यूटेंट बनाम जंगली प्रकार में प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर यों की अनुमति देता है, क्योंकि इस तरह के विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है. एक इस्तेमाल कर सकते हैं Immunofluorescent प्रतिदीप्ति की मात्रा का ठहराव के कारण पिक्सल के सभी पता लगाने 6 के रैखिक सीमा के भीतर हो कि सख्त जरूरतों को कम मजबूत है, इसी तरह के परिणाम प्राप्त करने के लिए विश्लेषण करती है. इसके अतिरिक्त, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण, अन्य जानकारी उपलब्ध करा सकता है इस तरह के एकप्रोटीन posttranslationally संशोधित किया गया है या एक विशिष्ट ब्याह isoform से व्यक्त किया जाता है. पृथक चरणों भी subcellular fractionation या coimmunoprecipitation सहित आगे प्रोटीन शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
स्टेज विशेष कूप अलगाव भी इन विट्रो विकास assays 7 और रहते इमेजिंग 8 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पृथक S10B-S13 रोम (नीचे देखें) सरल संस्कृति मीडिया में S14 के लिए विकसित करने के लिए जारी रहेगा. यह S10A के रोम इस पांडुलिपि में चर्चा की संस्कृति शर्तों का उपयोग डंपिंग नर्स सेल के माध्यम से प्रगति नहीं होगी कि नोट करना महत्वपूर्ण है. हम पढ़ने के बहिष्कार 7,9 के रूप में नर्स डंपिंग सेल और विकास का उपयोग करके actin remodeling को विनियमित करने में, दोनों औषधीय और आनुवंशिक रूप से, prostaglandins की भूमिका को परिभाषित करने के लिए S10B इन विट्रो विकास assays का इस्तेमाल किया है. इसी तरह, विकास के बाद के चरणों में भी pharmacologic उपचार या आनुवंशिक आदमी के प्रभावों का निर्धारण करने के लिए अलग किया जा सकता हैऐसे केन्द्राभिमुख सेल प्रवास, पृष्ठीय उपांग माइग्रेशन / गठन 10, और नर्स कोशिका मृत्यु के रूप में विशेष प्रक्रियाओं पर ipulations. ऐसे assays प्रमुख बातचीत स्क्रीन या assays के प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, PXT में या fascin अकेले परिवर्तन के लिए heterozygosity S10B इन विट्रो विकास पर कोई प्रभाव नहीं है, जबकि डबल heterozygotes प्रदर्शनी नर्स सेल दोष और विकास 9 में एक ब्लॉक डंपिंग से रोम.
S10B -13 संस्कृति में विकसित कर सकते हैं, क्योंकि इसके साथ ही, इस समय के दौरान होने वाले प्रक्रियाओं के सभी रहते इमेजिंग द्वारा मनाया जा सकता है. ऐसे इमेजिंग बस फ्लोरोसेंट जांच या लाइव इमेजिंग रंगों के साथ दाग के रोम व्यक्त ट्रांसजेनिक मक्खियों का उपयोग (एक आकृति विज्ञान में सकल परिवर्तन में ही दिलचस्पी है तो) प्रेषित प्रकाश का उपयोग कर या confocal माइक्रोस्कोपी के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है. लाइव इमेजिंग काफी विकास की प्रक्रिया के बारे में हमारी समझ अग्रिम करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है. दरअसल, कल्पना रहते हैंदेर से मंच के रोम के ग्राम पृष्ठीय उपांग प्रवास का ज्ञान, tubulogenesis 10 का एक उदाहरण का विस्तार किया गया. हम डंपिंग नर्स सेल दौरान actin गतिशीलता सहित अतिरिक्त देर चरण प्रक्रियाओं, के रहते इमेजिंग इन विकासात्मक घटनाओं में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा उम्मीद है. यह S10A और कूप विकास के प्रारंभिक दौर संस्कृति में एक S14 में विकसित करने के लिए जारी नहीं किया जाएगा, जबकि विकास के उन चरणों के दौरान होने वाली घटनाओं के लाइव इमेजिंग (अधिक के लिए चर्चा देखने वैकल्पिक संस्कृति शर्तों 11-14 का उपयोग संभव है कि नोट करना महत्वपूर्ण है जानकारी).
यहाँ हम या तो इन विट्रो विकास के लिए देर से मंच के रोम अलग करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और रहते इमेजिंग, या आणविक विश्लेषण (mRNA और प्रोटीन अलगाव).
Protocol
Representative Results
Discussion
ड्रोसोफिला कूप शब्द के भागों और आणविक विश्लेषण दोनों के लिए आदर्श बना रही है, कोशिका प्रकार के केवल एक छोटी संख्या से बना है. इसके अलावा, के कारण अंडाशय की संरचना करने के लिए, यह एक आम विदारक गुंजाइश ह?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अभिकर्मकों के लिए थॉमस Lecuit (sqh-Utrophin :: GFP लाइन), ब्लूमिंगटन स्टॉक केंद्र, और विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक को धन्यवाद देना चाहूंगा. हम आगे पांडुलिपि की उपयोगी चर्चा और आलोचनाओं के लिए तुरही बजाना लैब के सभी सदस्यों को धन्यवाद. धन से राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन एमसीबी-1158527, और शारीरिक रचना और सेल बायोलॉजी विभाग की ओर से शुरू हुआ धन, आयोवा विश्वविद्यालय के इस काम का समर्थन किया. भेषज विज्ञान T32GM067795 में स्वास्थ्य predoctoral प्रशिक्षण अनुदान के राष्ट्रीय संस्थानों AJS का समर्थन किया. डाटा भंडारण समर्थन अनुसंधान संसाधन के लिए राष्ट्रीय केन्द्र और अनुदान UL1RR024979 के माध्यम से translational विज्ञान, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान, आगे बढ़ाने के लिए राष्ट्रीय केन्द्र द्वारा समर्थित सीटीएसए के माध्यम से वित्त पोषित है जो आईसीटी, द्वारा प्रदान किया गया.
Materials
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | Any source of Active Dry Yeast is fine |
| Grace’s Insect Media | Lonza | 04-457F | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | Any Heat Inactivated FBS should work |
| 10x Pen/Strep | Gibco/Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises and Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Spot Plate, Nine Well | Corning | 7220-85 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 24 multi-well plates | Becton Dickinson | 35 3226 | Any 24-well tissue culture dish should work |
| Coverslip Bottom Dishes (35mm) | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used |
| Glass pipettes | Corning | 7095B-5x (for transferring follicles) | |
| Glass pipettes – long | Corning | 7095B-9 (for producing pulled pipettes) | |
| Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free) | Research Products International | 199228 | Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
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