의 유틸리티 스테이지 별 중후반<em> 초파리</em> 난포 격리
Summary
중후반 초파리 여포의 단계 별 분리는 다양한 목적에 유용합니다. 이러한 모낭이 체외 개발 분석 및 라이브 영상과 결합하는 유전자 및 / 또는 약물 조작이 가능 문화, 발전. 또한, 모낭은 mRNA와 단백질을 단리 같은 분자 연구에 사용될 수있다.
Abstract
초파리의 난자 또는 난포 발달 널리 복잡한 발달 및 세포 생물학 프로세스의 이해를 사전에 이용되고있다. 이 방법 종이 중후반 단계 여포 (단계 10B-14)를 분리하고 개발 시간을 꽉 창 중에 발생하는 분자 형태 학적 이벤트에 새로운 통찰력을 제공하기 위해이를 활용하는 방법에 대해 설명합니다. 격리 모낭 체외 개발 분석법, 라이브 영상, mRNA 발현 분석 및 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 포함한 실험 기법의 다양한 위해 사용될 수있다. 단계 (b) (S10B)에서 이상 모공 문화 개발을 완료 할 것이다, 이것은 하나의 개발의 특정 기간 동안 발생하는 과정에서 이러한 조작의 효과를 정의하기 위해 체외 개발 유전 약리학 적 교란을 결합 할 수 있습니다. 이러한 모공은 문화 발전하기 때문에 또한, 그들은 이상적으로 라이브 영상 연구에 적합종종 형태 학적 사건을 중재 새로운 메커니즘을 공개한다. 격리 여포 또한 분자 분석을 위해 사용될 수있다. 예를 들어, 유전 섭동 인한 유전자 발현의 변화는 특정 발달 윈도우에 대해 정의 될 수있다. 또한, 소낭 개발 특정 단계 동안 단백질 수준, 안정성 및 / 또는 번역 후 변형 상태는 웨스턴 블롯 분석을 통해 검사 할 수있다. 따라서, 초파리 여포의 단계 별 분리 개발 및 형태 형성의 널리 보존 프로세스에 풍부한 정보를 제공한다.
Introduction
각 초파리의 난소는 16 ovarioles, 또는 순차적으로 성숙 계란 챔버 또는 여포의 체인 ~로 구성되어있다. 각각의 뿌리가 하나의 난자, 15 세균 라인 파생 간호사 또는 지원 세포, 모낭 세포 (그림 1A)라고 ~ 650 체세포로 구성되어있다. 초파리의 난자가 개발 한 14 형태 학적으로 정의 된 단계로 나누어 져 있습니다. 난포 전개의 각 단계는 비교적 쉽게 스테이지 특정 모낭의 상당수를 분리하게, 단일 플라이 내에 여러 번 관찰된다.
난자 (10B-14 스테이지)의 중후반 단계 (그림 1) 단계의 분리에 특히 적합하다. 단계 10B (S10B)에서, 모낭 완전히 (즉, 그 길이가 14 단계 (S14) 모낭과 동일하다,도 1 및도 2H를 참조)으로 연장되고 모낭의 절반 길이는 널스 세포로 구성된다나머지 절반은 난자 (그림 1C) 동안. 이 단계에서 간호사 세포는 대뇌 피질의 액틴을 강화하고 액틴 필라멘트 2의 병렬 번들을 생성, 극적인 말라 리모델링을 받고있다. 동시에, 모낭 세포의 인구는 간호사 세포와 난자 사이에 마이그레이션, 구심 세포라고하고, 모낭 세포의 두 지느러미 그룹 등의 부속 기관, 배아 3 관 호흡 장치를 형성하기 위해 마이그레이션을 받아야 지정된 될 . 간호사가 배아 (그림 1D)를 완료하는 데 필요한 요인으로 난자를 제공 간호사 전지 덤핑라는 과정에서 난자에 자신의 세포질 내용을 짜내는 다음 계약 (S11), 세포. 간호사 세포는 세포 사멸 (S12-S13) 4를 받아야하고, 여포 세포는 달걀 껍질 5 (그림 1E-G)를 분비 및 패턴입니다. 따라서 난자의 끝이 중요한 발달이 풍부합니다D 형태 형성 과정.
격리 중후반 스테이지 여포 (S10B-S14)는 분자 분석 등 다양한 목적을 위해 사용될 수있다. 예를 들어, 단계적 모낭으로부터의 mRNA를 RT-PCR, 마이크로 어레이에 대해 분리 될 수 있고, 또는-RNA 서열 분석. 이것은 하나의 존재 단지 몇 종류의 세포로, 짧은 개발 윈도우 내에서 유전자 발현을보고, 유전자 발현이 약물이나 유전자 중 하나 섭동에 의해 변경하는 방법을 확인할 수 있습니다. 단 분리는 웨스턴 블로 팅에 의해 단백질을보고하는 데 사용할 수 있습니다. 그것은 하나의 특정 단계에서 돌연변이 대 야생형 단백질의 발현 수준을 정량 할 수 있기 때문에 이러한 분석은 중요하다. 하나를 사용할 수 있지만 면역 형광 정량 인해 모든 화소가 검출 6의 선형 범위 내에 엄격한 요구에 덜 견고, 비슷한 결과를 얻을 분석한다. 또한, 웨스턴 블롯 분석은 다른 정보를 제공 할 수있다 이러한발 단백질 posttranslationally 개질되거나 특정 스플 라이스 이소로부터 발현되는 경우. 격리 단계는 세포 이하 분획 또는 coimmunoprecipitation 포함한 상기 단백질 정제를 위해 사용될 수있다.
스테이지 별 모낭 분리는 체외 개발 분석 7과 라이브 영상 8 사용할 수 있습니다. 고립 된 S10B-S13 여포 (아래 참조) 간단한 배지에 S14을 개발하는 것입니다. 그것은 S10A 모낭이 원고에서 논의 된 배양 조건을 사용하여 덤핑 간호사 셀을 진행하지 않을 것을주의하는 것이 중요합니다. 우리는 읽기 아웃 7,9로 간호사 덤핑 세포 및 개발을 사용하여 말라 리모델링을 조절하는 두 약리학 적 및 유전, 프로스타글란딘의 역할을 정의 할 수 S10B 체외 개발 분석을 사용했다. 마찬가지로, 개발 후기 단계는 약물 치료 또는 유전자 남자의 효과를 결정하기 위하여 분리 될 수있다이러한 구심 세포 이동, 등의 부속기 마이그레이션 / 대형 10, 간호사 세포의 죽음과 같은 특정 프로세스에 대한 ipulations. 이러한 분석이 지배적 인 상호 작용 화면이나 분석을 수행 할 수 있습니다, 예를 들어, PXT 또는 fascin 혼자 돌연변이 이형은 S10B 체외 발달에 영향을주지하면서, 이중 이형 전시 간호사 세포 결함 및 개발 9 블록을 덤프에서 난포.
S10B-13 배양에서 발전 할 수 있기 때문에 또한,이 시간 동안 발생하는 모든 프로세스는 실시간 이미징에 의해 관찰 될 수있다. 이러한 영상은 단순히 형광 프로브 또는 라이브 영상 염료로 염색 모공을 표현 형질 전환 초파리를 사용하여 (한 형태의 심한 변화에만 관심이있는 경우) 투과광을 사용하거나 공 초점 현미경을 수행 할 수 있습니다. 라이브 영상은 실질적으로 발달 과정에 대한 우리의 이해를 사전에 사용하고 있습니다. 실제로, 걸 보면 라이브말기 여포의 G는 등의 부속기 이주의 지식, 세뇨관 (10)의 예를 확장했다. 우리는 투기 간호사 셀 동안 말라 역학 등의 추가 최종 단계 프로세스의 라이브 영상이 발달 이벤트에 새로운 통찰력을 제공 할 것으로 기대합니다. 그것은 S10A 및 난포 발달의 초기 단계는 문화 S14에 개발을 계속하는 것은 아니지만 개발하는 단계에서 발생하는 이벤트의 라이브 영상은 (이상 설명을 참조 다른 배양 조건에게 11 ~ 14를 사용 할 수 있습니다하는 것이 중요합니다 정보).
여기에서 우리는 하나의 생체 개발을위한 최종 단계 모낭 분리에 대한 자세한 프로토콜을 제공하고 라이브 영상, 또는 분자 분석 (mRNA와 단백질 격리).
Protocol
Representative Results
Discussion
초파리의 뿌리는 형태 학적 및 분자 분석 모두에 이상적, 세포 유형의 작은 숫자로 구성되어 있습니다. 한층 인해 난소의 구조, 평범한 해부 범위 및 최소한의 교육 난포 개발의 특정 단계를 다수 구하는 것이 상대적으로 쉽다. 각 단계는 짧은 시간 창을 나타내는 바와 같이, 단 분리는 그 단계에서 발생하는 발달 과정에 중요한 분자 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 S10B, S12…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 시약 토마스 Lecuit (SQH-Utrophin :: GFP 라인), 블루밍턴 증권 센터 및 발달 연구 브리 도마 은행에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 원고의 도움이 토론과 비판에 대한 잡담 연구소의 모든 구성원을 감사드립니다. 자금은 국립 과학 재단 MCB-1158527, 그리고 해부학 및 세포 생물학 부서에서 창업 자금, 아이오와의 대학은이 작업을 지원했다. 약리 과학 T32GM067795 건강 Predoctoral 교육 그랜트의 국립 연구소는 AJS을 지원했다. 데이터 스토리지 지원은 연구 자원을위한 국립 센터와 그랜트 UL1RR024979을 통해 번역 상 과학, 건강의 국립 연구소를, 전진을위한 국립 센터에서 지원하는 CTSA 재정 지원을 통해 ICTS에 의해 제공되었다.
Materials
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | Any source of Active Dry Yeast is fine |
| Grace’s Insect Media | Lonza | 04-457F | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | Any Heat Inactivated FBS should work |
| 10x Pen/Strep | Gibco/Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises and Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Spot Plate, Nine Well | Corning | 7220-85 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 24 multi-well plates | Becton Dickinson | 35 3226 | Any 24-well tissue culture dish should work |
| Coverslip Bottom Dishes (35mm) | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used |
| Glass pipettes | Corning | 7095B-5x (for transferring follicles) | |
| Glass pipettes – long | Corning | 7095B-9 (for producing pulled pipettes) | |
| Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free) | Research Products International | 199228 | Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
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