The Utility of Stage-spesifikke Mid-to-sen<em> Drosophila</em> Follikkel Isolation

Summary

Stage-spesifikke isolering av midten til slutten av Drosophila follikler er nyttig for en rekke formål. Slike follikler utvikle seg i kultur, noe som gjør det mulig for genetiske og / eller farmakologiske manipulasjoner for å bli kombinert med in vitro utviklings analyser og levende avbildning. I tillegg kan follikler benyttes til molekylære studier, for eksempel isolering av mRNA og protein.

Abstract

Drosophila oogenesen eller follikkelutvikling har vært mye brukt for å fremme forståelsen av komplekse utviklings-og celle biologiske prosesser. Dette metoder beskriver hvordan man kan isolere midten til sent stadium follikler (Stage 10B-14), og utnytte dem til å gi ny innsikt i de molekylære og morfologiske hendelser under tette vinduer av utviklings tid. Isolerte follikler kan brukes for en rekke eksperimentelle teknikker som in vitro assays utvikling, direkte avbildning, mRNA ekspresjon analyse og western blot-analyse av proteiner. Follikler på Stage 10B (S10B) eller senere vil fullføre utviklingen i kultur, og dette gjør det mulig å kombinere genetiske eller farmakologiske forstyrrelser med in vitro utvikling for å definere effekten av slike manipulasjoner på de prosesser som oppstår under bestemte perioder av utviklingen. I tillegg, fordi disse folliklene utvikler seg i kultur, de er ideell for live imaging studier, Som ofte avslører nye mekanismer som formidler morfologiske hendelser. Isolerte follikler kan også brukes for molekylære analyser. For eksempel kan forandringer i gen-ekspresjon som er resultatet av genetiske forstyrrelser være definert for spesifikke utviklings vinduer. I tillegg kan protein-nivå, stabilitet og / eller posttranslational modifikasjon tilstand under en bestemt fase av follikkelutvikling undersøkes ved western blot analyser. Dermed scenen spesifikke isolering av Drosophila folliklene gir en rik kilde til informasjon i allment bevarte prosesser for utvikling og morphogenesis.

Introduction

Hver Drosophila eggstokk er sammensatt av ~ 16 ovarioles, eller kjeder av sekvensielt modning egg kamre eller follikler. Hver follikkel er sammensatt av en enkelt oocyte, 15 bakterie linje avledet sykepleier eller støttelegemer, og ~ 650 somatiske celler betegnet follicle celler (figur 1A). Drosophila oogenesen er delt inn i 14 morfologisk definerte utviklingsstadier ^1.. Hvert trinn av follikkelutvikling observeres mange ganger i løpet av en enkelt fly, noe som gjør det relativt lett å isolere et betydelig antall stadium-spesifikke follikler.

De midten til slutten stadier av oogenesen (Stages 10B-14) er spesielt godt egnet for scenen isolasjon (Figur 1). På Stage 10B (S10B), er hårsekken fullt langstrakt (dvs. dens lengde er lik som i en Stage 14 (S14) hårsekken, se figur 1 og figur 2 H) og halve lengden av hårsekken er sammensatt av sykepleier cellermens den andre halvdelen er oocytten (figur 1C). På dette stadiet sykepleier celler gjennomgå dramatiske aktin ombygging, styrke kortikale aktin og genererer parallelle bunter av aktin filamenter ^to. På samme tid, en populasjon av follicle celler, betegnet sentripetale celler, migrere inn mellom sykepleier celler og oocytt, og to rygg grupper av follicle celler blir bestemt til å gjennomgå migrasjon for å danne rygg vedheng, rørformede respiratoriske aggregater av embryoet ³ . Sykepleieren cellene deretter kontrakt (S11), klemme sine cytoplasmatiske innholdet i eggcelle i en prosess som kalles sykepleier celle dumping, noe som gir eggcelle med de faktorer som er nødvendige for at den skal fullføre embryogenese (figur 1D). Sykepleieren cellene deretter gjennomgå celledød (S12-S13) ^4, og hårsekken cellene skiller og mønster eggeskallet ⁵ (Tall 1E-G). Dermed er slutten av oogenesen rik med viktig utviklings end morphogenetic prosesser.

Isolerte midten til sent stadium follikler (S10B-S14) kan brukes til en rekke formål, inkludert molekylære analyser. For eksempel kan mRNA fra iscenesatte follikler isoleres for RT-PCR, microarray, eller RNA-seq analyser. Dette gjør det mulig å se på genekspresjon innen kort utviklings vindu, med bare noen få celletyper som finnes, og finne ut hvordan genuttrykk endres ved enten farmakologiske eller genetiske forstyrrelser. Stage isolasjon kan også brukes til å se på proteiner av western blotting. Slike analyser er viktig fordi det gjør det mulig å kvantifisere nivået av proteinekspresjon i villtype-versus mutanter på bestemte stadier. Mens man kan bruke immunofluorescent analyser for å oppnå lignende resultater, kvantifisering av fluorescens er mindre robust på grunn av de strenge krav til at alle pikslene være innenfor det lineære området for påvisning ^6.. I tillegg kan western blot analyse gi annen informasjon, for eksempel ens hvis proteinet er posttranslationally modifisert eller uttrykkes fra en bestemt spleise isoform. Isolerte stadier kan også brukes for ytterligere protein rensing, inkludert subcellulære fraksjonering eller coimmunoprecipitation.

Stage spesifikke hårsekken isolasjon kan også brukes for in vitro utviklings analyser ⁷ og live-imaging ^åtte. Isolerte S10B-S13 follikler vil fortsette å utvikle seg til S14 i enkle dyrkingsmedier (se nedenfor). Det er viktig å merke seg at S10A follikler ikke vil fremgang gjennom sykepleier celle dumping ved hjelp av kultur forhold som omtales i dette manuskriptet. Vi har brukt S10B in vitro utviklings analyser for å definere rollen til prostaglandiner, både farmakologisk og genetisk, i å regulere aktin ombygging ved hjelp av sykepleier celle dumping og utvikling som leser-outs ^7,9. På samme måte kan de senere stadier av utviklingen også være isolert for å bestemme effekten av farmakologiske behandlinger eller genetisk menneskeipulations på bestemte prosesser som sentripetal celle migrasjon, rygg vedheng migrasjon / formasjon ^10, og sykepleier celledød. Slike analyser kan brukes til å utføre dominerende interaksjons skjermer eller analyser, for eksempel, mens heterozygosity for mutasjoner i PXT eller fascin alene har ingen effekt på S10B in vitro utvikling, follikler fra doble heterozygotes utstillings sykepleier celle dumping defekter og en blokk i utvikling ^9.

I tillegg, fordi S10B-13 kan utvikle seg i kultur, alle de prosesser som skjer i løpet av denne tiden kan observeres av live-imaging. Slike bildebehandling kan utføres bare ved hjelp overført lys (hvis man er bare interessert i brutto endringer i morfologi) eller med konfokalmikroskopi bruker transgene fluer uttrykker fluorescerende prober eller follikler farget med levende bildefargestoffer. Sanntids avbildning blir brukt til i det vesentlige å fremme forståelsen av utviklingsprosesser. Faktisk lever imaging sent stadium follikler har utvidet kunnskapen om rygg vedheng migrasjon, et eksempel på tubulogenesis ^10. Vi forventer at levende avbildning av ekstra sent stadium prosesser, herunder aktin dynamikk under sykepleier celle dumping, vil gi ny innsikt i disse utviklings hendelser. Det er viktig å merke seg at mens S10A og tidlige stadier av follikkelutvikling ikke vil fortsette å utvikle seg til en S14 i kultur, er mulig leve-avbildning av hendelser som skjer i løpet av de stadier av utviklingen ved hjelp av alternative kulturforhold ^11-14 (se diskusjon for mer informasjon).

Her gir vi detaljerte protokoller for å isolere sent stadium follikler for enten in vitro utvikling og leve-bildebehandling, eller molekylære analyser (mRNA og protein isolasjon).

Protocol

En. Forbereder Drosophila Før Stage Isolation Lag våte gjærpasta ved å kombinere 50 g av aktiv tørrgjær med 90 ml destillert vann. Bland med en slikkepott til å kombinere. La blandingen stå i ~ 30 minutter før måling konsistens. Konsistensen skal være like tykk nok til å følge den siden av en flue hetteglass, men ikke kjøre ned på siden. For å oppnå den ønskede konsistens kan det være nødvendig å tilsette opp til 10 ml med ytterligere vann eller en liten mengde av tørrgjær. Opp…

Representative Results

Når isolere spesifikke stadier av Drosophila follikkelutvikling er det viktig å være i stand til å nøyaktig skille de ulike morfologiske stadier. Det er noe vanskelig for S10A og S10B, som sykepleier celler og oocyte hver tar opp halve lengden av hårsekken på disse stadier (figur 1B i forhold til 1C). Men S10A follikler er kortere i lengden enn S10B follikler, som S10B follikler er fullt langstrakt og dermed lik i lengde til en S14 hårsekken (figur 1C f…

Discussion

Den Drosophila follicle består av bare et lite antall av celletyper, noe som gjør den ideell for både morfologiske og molekylære analyser. Videre, på grunn av strukturen av eggstokk, er det relativt enkelt å få tak i store mengder spesifikke faser av follikkelutvikling med en felles dissekere omfang og minimal opplæring. Som hvert trinn representerer et kort tidsmessig vindu, kan scenen isolasjon gi betydelige molekylære innsikt i utviklingsprosesser som oppstår under det stadiet. For eksempel har vi …

Materials

Active Dry Yeast	Genesee Scientific	62-103	Any source of Active Dry Yeast is fine
Grace’s Insect Media	Lonza	04-457F
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11050H	Any Heat Inactivated FBS should work
10x Pen/Strep	Gibco/Invitrogen	15140-122
Pin Vises and Needles	Ted Pella, Inc.	13561-10
Spot Plate, Nine Well	Corning	7220-85
#5 Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-20
24 multi-well plates	Becton Dickinson	35 3226	Any 24-well tissue culture dish should work
Coverslip Bottom Dishes (35mm)	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used
Glass pipettes	Corning	7095B-5x (for transferring follicles)
Glass pipettes – long	Corning	7095B-9 (for producing pulled pipettes)
Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free)	Research Products International	199228	Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used
Trizol	Invitrogen	15596-018