Une méthode sensible pour quantifier les cellules sénescentes du cancer
Summary
Que la sénescence empêche ou favorise la tumorigenèse reste controversée. Comme les médicaments chimiothérapeutiques peuvent induire des cellules cancéreuses à vieillir, est essentiel à étudier la sénescence de proposer de nouvelles thérapies. Cependant, le test β-galactosidase standard et largement utilisé présente des inconvénients majeurs. Nous vous proposons ici un test basé sur la cytométrie flux rapide et sensible pour quantifier la sénescence.
Abstract
Les cellules humaines ne sont pas indéfiniment prolifèrent. Dès indices externes et / ou intrinsèque, les cellules peuvent mourir ou entrer un arrêt du cycle cellulaire stable appelé sénescence. Plusieurs mécanismes cellulaires tels que le raccourcissement des télomères et une expression anormale d'oncogènes mitogènes, ont été montré pour causer la sénescence. La sénescence n'est pas limitée aux cellules normales, les cellules cancéreuses ont également été signalés à vieillir.
médicaments chimiothérapeutiques ont été montré pour induire la sénescence dans les cellules cancéreuses. Cependant, il reste controversée que la sénescence empêche ou favorise la tumorigenèse. Comme il pourrait éventuellement être spécifique au patient, une méthode rapide et sensible pour évaluer la sénescence des cellules du cancer sera bientôt nécessaire.
À cette fin, le test β-galactosidase standard, la méthode actuellement utilisée, présente des inconvénients majeurs: il est temps et n'est pas sensible. Nous vous proposons ici un test basé sur la cytométrie flux d'étudier la sénescence sur live cellules. Ce test présente l'avantage d'être rapide, sensible et peut être couplé à l'immuno-marquage de différents marqueurs cellulaires.
Introduction
Depuis le début des années soixante et sa découverte par Hayflick et Moorhead, sénescence reste une curiosité cellulaire 1. Les cellules humaines ne sont pas indéfiniment prolifèrent et, par la sénescence, Hayflick et Moorhead a inventé le processus cellulaire de vieillissement. Sénescence est un arrêt du cycle cellulaire stable dans laquelle les cellules restent métaboliquement active, par opposition à la mort cellulaire. À ce jour, quatre mécanismes cellulaires ont été montré pour induire la sénescence: le raccourcissement des télomères, des dommages de l'ADN, la chromatine perturbation, et une expression anormale d'oncogènes mitogènes 2. Cela signifie que non seulement les cellules normales mais également les cellules cancéreuses sont capables de subir la sénescence 3. En fait, les cellules cancéreuses subissent sénescence ont été présentés à constituer un obstacle à la progression tumorale 4-5. Cependant, plusieurs rapports ont souligné que, dans certaines circonstances, la sénescence cellulaire peut également favoriser la malignité 6-7. L'étude de la sénescence du cancer cells est en passe de devenir un besoin en recherche sur le cancer tels qu'ils sont actuellement utilisés médicaments chimiothérapeutiques peuvent conduire à la sénescence des cellules cancéreuses non seulement in vitro mais aussi in vivo 8.
Le dosage de maître pour étudier la présence de cellules sénescentes est le test β-galactosidase à pH acide. Ce test histochimique reflète l'augmentation de la biogenèse des lysosomes se produisant dans la plupart des cellules sénescentes. Brièvement, exogène X-gal, appliqué à des cellules, est clivé par β-galactosidase enrichi dans les lysosomes des cellules sénescentes, donnant lieu à une couleur bleue 9. Les cellules sénescentes bleus peuvent ensuite être quantifiés sous un microscope en champ clair. Bien que très populaire, le dosage de β-galactosidase présente des inconvénients majeurs. En premier lieu, ce test est réalisé sur des cellules fixées. Deuxièmement, il est temps car elle implique de quantifier le degré de sénescence en comptant un nombre significativement plus élevé de cellules sénescentes sous un microscope. Troisièmement, cet essain'est pas aussi sensible que la discrimination entre les cellules sénescentes et non sénescentes repose entièrement sur l'observateur.
Nous discutons ici, un test basé sur la cytométrie rapide et sensible inexploité pour évaluer la présence de cellules sénescentes en direct. Ce dosage est basé sur l'hydrolyse de la molécule de la membrane perméable, la 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside (C 12 FDG), par β-galactosidase enrichie en cellules sénescentes. Après hydrolyse et une excitation laser, le C 12 FDG émet une fluorescence verte et peut donc être détecté par cytométrie de flux 10, 11. La détection de cellules sénescentes par cytométrie en flux offre le grand avantage d'être rapide et sensible. En outre, la détection de cellules sénescentes par cytométrie de flux peut être couplé avec la détection d'autres marqueurs cellulaires. Ce test peut être utilisé pour détecter les cellules sénescentes sein d'une population de cellules cancéreuses traitées avec la chimiothérapie et peut être régulièrement missur des coupes de tissus, après dissociation cellulaire, dans la clinique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons présenté ici une méthode cytométrie en flux offre de quantifier la sénescence cellulaire dans les cellules cancéreuses vivantes. Cette méthode est basée sur l'utilisation du composé perméable de la membrane, la C 12 FDG, et peut donc être utilisé dans tous les types de cellules et après divers traitements aussi longtemps que le composé est absorbé par les cellules. Après l'absorption cellulaire, la C 12 FDG est hydrolysé par la β-galactosidase, enrichi en lysoso…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le SF 4206 ICORE (Université de Caen) pour l'utilisation de la facilité de cytométrie. JC reçu des bourses post-doctorales du Conseil de Radioprotection d'EDF et le Conseil Régional de Basse-Normandie. Ces données font partie des projets financés par la Ligue Nationale contre le Cancer – Comités de l'Orne et du Calvados.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside | Invitrogen | D-2893 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | |
| Doxorubicin | Sandoz | ||
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| RPMI 1640 cell culture medium | Lonza | BE12-702 | |
| Fetal calf serum | PAA Laboratories GmBH | A15 101 | |
| Antibiotics | Gibco | 5290-018 | |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | A94291 |
References
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