Eine empfindliche Methode zur Quantifizierung Seneszente Cancer Cells
Summary
Ob Seneszenz verhindert oder fördert Tumorentstehung bleibt umstritten. Da Chemotherapeutika Krebszellen veranlassen können, altern, Studium Seneszenz ist für Vorschläge für neue Therapien unerlässlich. Allerdings stellt die Standard-und im Großen und Ganzen verwendet β-Galactosidase Assay große Nachteile. Wir schlagen hier eine schnelle und empfindliche Durchflusszytometrie-basierte Assays zur Quantifizierung Seneszenz.
Abstract
Menschliche Zellen nicht unbegrenzt vermehren. Bei externen und / oder intrinsische Signale könnten Zellen sterben oder geben Sie einen stabilen Zellzyklus genannt Seneszenz. Mehrere zellulären Mechanismen, wie Telomerverkürzung und abnormale Expression mitogene Onkogene, haben gezeigt, dass Seneszenz bewirken. Seneszenz nicht auf normalen Zellen beschränkt; Krebszellen haben auch berichtet, altern.
Chemotherapeutika wurde gezeigt, Seneszenz in Krebszellen zu induzieren. Es bleibt jedoch umstritten, ob Seneszenz verhindert oder fördert Tumorentstehung. Als es schließlich könnte Patienten-spezifischen, wird eine schnelle und empfindliche Methode zur Seneszenz in Krebszelle beurteilen bald erforderlich sein.
Zu diesem Zweck stellt die Standard-β-Galactosidase-Assay wird die aktuell verwendete Methode, wesentliche Nachteile: es ist zeitaufwendig und nicht empfindlich. Wir schlagen hier eine Durchflusszytometrie-basierte Assays zur Seneszenz auf li studierenve Zellen. Dieser Test hat den Vorteil, dass eine schnelle, empfindliche und können zur Immunmarkierung von verschiedenen zellulären Marker gekoppelt werden.
Introduction
Seit Anfang der sechziger Jahre und seiner Entdeckung durch Hayflick und Moorhead, Seneszenz bleibt eine zelluläre Neugier 1. Menschliche Zellen nicht unbegrenzt vermehren und durch Seneszenz Hayflick und Moorhead den zellulären Alterungsprozess geprägt. Seneszenz ist eine stabile Arretierung des Zellzyklus in dem Zellen metabolisch aktiv bleiben, um Zelltod entgegen. Bisher wurden vier zellulären Mechanismen gezeigt, Seneszenz induzieren: Verkürzung der Telomere, DNA-Schäden, Chromatin Störung und abnormale Expression von Onkogenen mitogene 2. Dies deutet darauf hin, dass nicht nur normale Zellen, sondern auch Krebszellen sind in der Lage, Seneszenz 3 zu unterziehen. In der Tat wurden Krebszellen unterziehen Seneszenz gezeigt, um eine Barriere zur weiteren Tumorprogression 4-5 darstellen. Allerdings haben einige Berichte nun darauf hin, dass unter bestimmten Umständen, zelluläre Seneszenz kann auch die Förderung Bösartigkeit 6-7 hingewiesen. Studieren Seneszenz von Krebs cells ist im Begriff, ein Drang in der Krebsforschung als derzeit verwendeten Chemotherapeutika können Seneszenz von Krebszellen nicht nur in vitro, sondern auch in vivo 8 führen werden.
Die Master-Assay, um das Vorhandensein von alternden Zellen zu untersuchen ist β-Galactosidase-Assay bei saurem pH-Wert. Diese histochemischen Test spiegelt die in lysosomalen Biogenese vorkommenden in den meisten alternden Zellen erhöht. Kurz gesagt, wird exogene X-gal, die auf Zellen von β-Galactosidase in Lysosomen von alternden Zellen angereichert gespalten, was zu einer blauen Farbe 9. Die blauen alternden Zellen können dann unter einem Hellfeld-Mikroskop quantifiziert werden. Obwohl sehr beliebt, stellt die β-Galactosidase Assay große Nachteile. Zuerst wird dieser Test auf fixierte Zellen durchgeführt. Zweitens ist es sehr zeitaufwendig, weil es um den Grad der Seneszenz durch Zählen eine signifikant hohe Anzahl von alternden Zellen unter einem Mikroskop zu quantifizieren impliziert. Drittens, dieser Testnicht empfindlich ist als die Unterscheidung zwischen alternden und nicht-alternden Zellen ganz auf die Betrachter.
Wir diskutieren hier ein ungenutztes, schnell und empfindlich Durchflusszytometrie basierende Assay auf das Vorhandensein von lebenden alternden Zellen beurteilen. Dieser Assay auf der Hydrolyse von einer Membran durchlässig Molekül, das 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranosid (C 12 FDG) basiert, durch β-Galactosidase in alternden Zellen angereichert. Nach der Hydrolyse-und Laser-Anregung emittiert der C 12 FDG grüne Fluoreszenz und kann daher mittels Durchflusszytometrie 10, 11 detektiert werden. Der Nachweis von alternden Zellen via Durchflusszytometrie bietet den großen Vorteil, dass sie schneller und empfindlicher. Darüber hinaus kann die Erfassung von alternden Zellen mittels Durchflusszytometrie mit der Detektion von anderen zellulären Marker gekoppelt werden. Dieser Test kann verwendet werden, um alternde Zellen in einer Population von Krebszellen mit einer Chemotherapie behandelt werden, erkennen und kann routinemäßig eingestellt werdenauf Gewebeschnitten nach zellulären Dissoziation, in der Klinik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir präsentierten hier eine Durchflusszytometrie basierende Methode, um zelluläre Seneszenz in lebenden Krebszellen zu quantifizieren. Diese Methode beruht auf der Verwendung der Membran durchlässig Verbindung, die C 12-FDG Basis und kann daher in allen Zelltypen und nach verschiedenen Behandlungen verwendet werden, solange die Verbindung von den Zellen aufgenommen. Nach Aufnahme in die Zelle ist die C 12 FDG hydrolysiert durch die β-Galactosidase, in Lysosomen von alternden Zellen angereichert…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem SF 4206 ICORE (Université de Caen) für die Nutzung der Durchflusszytometrie Anlage. JC erhielt Post-Doc-Stipendien aus Conseil de Strahlenschutz d'EDF und Conseil Régional der Basse-Normandie. Diese Daten wurden im Rahmen von Projekten von der Ligue Nationale contre le Cancer finanziert – Comités de l'Orne et du Calvados.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside | Invitrogen | D-2893 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | |
| Doxorubicin | Sandoz | ||
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| RPMI 1640 cell culture medium | Lonza | BE12-702 | |
| Fetal calf serum | PAA Laboratories GmBH | A15 101 | |
| Antibiotics | Gibco | 5290-018 | |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | A94291 |
References
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