Un método sensible para cuantificar las células cancerosas senescentes
Summary
Si senescencia previene o promueve la tumorigénesis sigue siendo controvertido. Como los fármacos quimioterapéuticos pueden inducir a las células cancerosas a la senescencia, el estudio de la senescencia es esencial para proponer nuevas terapias. Sin embargo, el ensayo de β-galactosidasa estándar y ampliamente utilizado presenta importantes inconvenientes. Proponemos aquí un ensayo de citometría basada rápido y sensible para cuantificar el flujo de la senescencia.
Abstract
Las células humanas no proliferan indefinidamente. Al señales externas y / o intrínsecos, las células pueden morir o introduzca un detención del ciclo celular estable llamado senescencia. Varios mecanismos celulares, tales como el acortamiento de los telómeros y la expresión anormal de oncogenes mitógenos, se ha demostrado que causa la senescencia. La senescencia no está restringida a las células normales, las células cancerosas también se ha informado de senescencia.
Fármacos quimioterapéuticos han demostrado inducir la senescencia en células de cáncer. Sin embargo, hay controversia sobre la senescencia previene o promueve la tumorigénesis. Como el tiempo podría ser específica del paciente, un método rápido y sensible para evaluar la senescencia en células de cáncer pronto será necesaria.
Para este fin, el ensayo de β-galactosidasa estándar, el método utilizado actualmente, presenta importantes inconvenientes: es mucho tiempo y no es sensible. Se propone aquí un ensayo de citometría de flujo basada en la senescencia de estudiar en liVE células. Este ensayo ofrece la ventaja de ser rápido, sensible, y puede ser acoplado a la inmunomarcación de diversos marcadores celulares.
Introduction
Desde principios de los años sesenta y su descubrimiento por Hayflick y Moorhead, senescencia sigue siendo una curiosidad celular 1. Las células humanas no proliferan indefinidamente y, por senescencia, Hayflick y Moorhead acuñaron el proceso celular de envejecimiento. La senescencia es una detención del ciclo celular estable en el que las células permanecen metabólicamente activa en oposición a la muerte celular. Hasta la fecha, cuatro mecanismos celulares se han mostrado para inducir la senescencia: acortamiento de los telómeros, daño en el ADN, perturbación de la cromatina, y la expresión anormal de oncogenes mitógenos 2. Esto indica que no sólo las células normales, pero también las células cancerosas son capaces de someterse a la senescencia 3. Como cuestión de hecho, las células de cáncer sometidos a la senescencia, se mostró a constituir una barrera para la progresión del tumor 4-5. Sin embargo, varios informes han señalado que, en determinadas circunstancias, la senescencia celular también puede promover la malignidad 6-7. El estudio de la senescencia de cáncer cells está a punto de convertirse en un impulso en la investigación del cáncer tal como se utilizan actualmente los fármacos quimioterapéuticos pueden conducir a la senescencia de las células cancerosas no sólo in vitro sino también in vivo 8.
El ensayo principal para investigar la presencia de células senescentes es el ensayo de β-galactosidasa a pH ácido. Este ensayo histoquímico refleja el aumento en la biogénesis lisosomal que ocurre en la mayoría de las células senescentes. Brevemente, exógeno X-gal, aplicada a las células, se escinde por la β-galactosidasa enriquecido en los lisosomas de las células senescentes, dando lugar a un color azul 9. Las células senescentes azules a continuación, pueden ser cuantificados con un microscopio de campo brillante. Aunque es muy popular, el ensayo de β-galactosidasa presenta mayores inconvenientes. En primer lugar, este ensayo se lleva a cabo en células fijadas. En segundo lugar, es mucho tiempo, ya que es necesario cuantificar el grado de senescencia contando un número significativamente alto de células senescentes bajo un microscopio. En tercer lugar, este ensayono es sensible como la discriminación entre las células senescentes y no senescentes se basa enteramente en el observador.
Se discuten aquí un ensayo de citometría basada sin explotar, rápida y sensible para evaluar la presencia de células senescentes en vivo. Este ensayo se basa en la hidrólisis de una molécula de membrana permeable, la 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopiranósido (C 12 FDG), por β-galactosidasa enriquecida en células senescentes. Después de la hidrólisis y de excitación láser, el C 12 FDG emite fluorescencia verde y por lo tanto puede ser detectada por citometría de flujo 10, 11. La detección de las células senescentes a través de citometría de flujo ofrece la gran ventaja de ser rápido y sensible. Además, la detección de las células senescentes por citometría de flujo se puede acoplar con la detección de otros marcadores celulares. Este ensayo se puede usar para detectar las células senescentes dentro de una población de células cancerosas tratadas con quimioterapia y se puede ajustar de forma rutinariaarriba en secciones de tejido, después de la disociación celular, en la clínica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Presentamos aquí un método basado en citometría de flujo para cuantificar la senescencia celular en las células cancerosas vivas. Este método se basa en el uso del compuesto permeable a la membrana, el C 12 FDG, y por lo tanto se puede utilizar en cualquier tipo de células y después de varios tratamientos, siempre y cuando el compuesto es absorbido por las células. Tras la captación celular, el C 12 FDG es hidrolizado por la β-galactosidasa, enriquecido en los lisosomas de las células se…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la SF 4206 ICORE (Université de Caen) para el uso de la instalación citometría. JC recibió becas post-doctorales del Consejo de Radioprotección d'EDF y Conseil Régional de Basse-Normandie. Estos datos forman parte de los proyectos financiados por la Ligue Nationale Contre le Cancer – Comités de l'Orne et du Calvados.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside | Invitrogen | D-2893 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | |
| Doxorubicin | Sandoz | ||
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| RPMI 1640 cell culture medium | Lonza | BE12-702 | |
| Fetal calf serum | PAA Laboratories GmBH | A15 101 | |
| Antibiotics | Gibco | 5290-018 | |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | A94291 |
References
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