Het meten van de mechanische eigenschappen van levende cellen door gebruik Atomic Force Microscopy

Summary

Deze paper toont een protocol om de mechanische eigenschappen van levende cellen te karakteriseren door middel van microindentation gebruik van een Atomic Force Microscope (AFM).

Abstract

Mechanische eigenschappen van cellen en extracellulaire matrix (ECM) spelen een belangrijke rol in vele biologische processen waaronder stamcel differentiatie, tumorvorming en wondgenezing. Veranderingen in stijfheid van cellen en ECM vaak tekenen van veranderingen in celfysiologie of ziektes in weefsels. Daarom cel stijfheid is een index om de status van celkweken evalueren. Onder de vele methoden die aan de stijfheid van cellen en weefsels te meten, micro-inkeping met een Atomic Force Microscope (AFM) biedt een manier om betrouwbare wijze de stijfheid van levende cellen. Deze methode is op grote schaal toegepast op de micro-schaal stijfheid karakterisering van verschillende materialen, variërend van metalen oppervlakken zachte biologische weefsels en cellen. Het basisprincipe van deze werkwijze is om een ​​cel inspringen met een AFM tip van geselecteerde geometrie en meet de uitgeoefende kracht de buiging van de AFM cantilever. Montage van de kracht-inkeping bocht naar de Hertz-modusl voor de bijbehorende tip geometrie kunnen kwantitatieve metingen van het materiaal stijfheid te geven. Deze paper toont de procedure om de stijfheid van levende cellen met behulp van AFM karakteriseren. Belangrijkste stappen waaronder het proces van de AFM kalibratie, kracht-curve acquisitie en data-analyse met behulp van een MATLAB routine worden gedemonstreerd. Beperkingen van deze methode worden ook besproken.

Introduction

Mechanische eigenschappen, met name stijfheid van afzonderlijke cellen en de omliggende extracellulaire matrix (ECM) zijn essentieel voor vele biologische processen zoals celgroei, motiliteit, celdeling, differentiatie en weefsel homeostase. ¹ Het is aangetoond dat cellen mechanische stijfheid mate wordt bepaald door het cytoskelet, vooral de netwerken van actine en intermediaire filamenten en andere eiwitten gekoppeld. ² Resultaten van de mechanische testen van de in vitro netwerken van actine en intermediaire filamenten suggereren dat de cel mechanica is grotendeels afhankelijk van de cytoskelet structuur en de voorspanning in het cytoskelet. ^3-5 Stijfheid van levende cellen wordt vervolgens beschouwd als een index om de cytoskelet structuur ^6, myosine activiteit ⁷ en vele andere cellulaire processen te evalueren. Belangrijker, veranderingen in cel mechanische eigenschappen vaak blijkt nauw associated met diverse aandoeningen zoals tumorvorming en metastase ^8-10 Monitoring de mechanische stijfheid van levende cellen kan derhalve een nieuwe manier om celfysiologie volgen;. te detecteren en diagnosticeren ziekten ^8;. en de doeltreffendheid van geneesmiddelen behandelingen evalueren ^{11 , 12}

Meerdere werkwijzen waaronder deeltjes volgen microrheology, ^13-16 magnetische verdraaien cytometry, ¹⁷ micropipet aspiratie ^18,19 en microindentation ^20-22 zijn ontwikkeld om de elasticiteit van de cellen te meten. Deeltje volgen microrheology traceert de thermische trillingen van beide submicrondeeltjes fluorescerende deeltjes geïnjecteerd in cellen of ijkmarkeringen in de cel cytoskelet. ²³ Elastisch en visceuze eigenschappen van cellen worden berekend op basis van de gemeten deeltjes verplaatsingen met de fluctuatie-dissipatie theorema. ^14,23 Deze methode maakt gelijktijdige metingen van lokalemechanische eigenschappen met een hoge ruimtelijke resolutie op verschillende plaatsen in een cel. Echter, injecteren fluorescerende deeltjes in cellen kan leiden tot veranderingen in cellulaire functie, cytoskelet structuur en dus de cel mechanics. De micropipet aspiratie methode is onderdruk in een micropipet met een diameter van 1 tot 5 urn op een klein stukje celmembraan zuigen in de pipet. Cell stijfheid wordt berekend uit de toegepaste onderdruk en celmembraan vervorming. ¹⁸ Deze werkwijze kan echter niet de ongelijkmatige verdeling van de stijfheid over de cel te detecteren. Magnetische twisting cytometrie (MTC) van toepassing magnetisch veld koppel aan super paramagnetische beads bevestigd aan het celmembraan genereren. Cell ¹⁷ stijfheid wordt verkregen in deze werkwijze van de relatie tussen de toegepaste torsie en de kronkelende vervorming van de celmembraan. Het is moeilijk om de locatie van de magnetische korrels in de werkwijze MTC controleren, en het is ook challenging tot de kronkelende vervorming met een hoge resolutie te karakteriseren. Microindentation geldt een indenter met goed gedefinieerde geometrie om punch in de cel. Het inspringen kracht en de resulterende inspringen in cellen volgen vaak de voorspelling van de Hertz-model. Young's moduli van de cellen kan worden berekend uit de kracht-indrukking curven aanpassen ervan aan de Hertz model. Deze methode is op grote schaal toegepast op de mechanische eigenschappen van de weefsels en cellen te testen, ondanks zijn beperkingen, zoals onzekerheid in contactpunt vastberadenheid, toepasbaarheid van de Hertz-model, en het potentieel om fysiek te beschadigen de cellen. Onder de vele apparaten voor microindentaion ^20, de Atomic Force Microscope (AFM) is in de handel verkrijgbaar en is op grote schaal toegepast op de mechanische eigenschappen van levende cellen en weefsels ^21,24-27 karakteriseren.

Deze paper toont de procedure van het gebruik van een asiel MFP3D-Bio AFM naar cel mechanica karakteriseren. AFM niet oply levert hoge-resolutie topografie van cellen, maar ook op grote schaal toegepast om de mechanische eigenschappen van weefselcellen karakteriseren. Het principe van AFM indrukking wordt geïllustreerd in figuur 1. De AFM cantilever nadert de cel van enkele micrometers hierboven, maakt contact met de cel streepjes de cel zodat de cantilever doorbuiging een voorgeselecteerd setpunt bereikt, en trekt vanaf de cel. Tijdens dit proces wordt de cantilever doorbuiging wordt geregistreerd als een functie van de locatie zoals weergegeven in figuur 1. Alvorens contact met de cel, de cantilever beweegt het medium zonder enige duidelijke afwijking. Wanneer inspringen op de cel, de cantilever bochten en de afbuigsignaal toeneemt. De cantilevers worden gemodelleerd als elastische balken zodat hun afbuiging evenredig is met de op het cel kracht. Door het instellen van de maximale cantilever doorbuiging, is de maximale grootte van de kracht toegepast op de steekproef beperkt tot d voorkomenAmage aan cellen. Het gedeelte van de kracht curve van punt b in figuur 1, waarbij de punt streepjes in de cel, is bekwaam tot het hertz model om de cel stijfheid extraheren naar punt c.

Figuur 1. Illustratie van de AFM microindentation en interpretatie van de geldende curve. Het bovenste paneel toont de beweging van AFM cantilever gedreven door de piëzo-scanner. De verticale locatie van cantilever z en cantilever uitwijkingssignaal d wordt geregistreerd gedurende het proces. De cantilever begint vanaf punt een, enkele micrometers boven de cel. Bij het naderen van de cel, het monster inkeping δ blijft nul tot het punt b, wanneer de punt in contact komt met de cel bereikt. De coördinaten van punt b in de plot zijn kritieke waardenvoor gegevensanalyse, aangeduid met (z _0, d _0>). Van b naar c, de cantilever streepjes in de cel totdat de cantilever doorbuiging bereikt een instelling, die is ingesteld op de verhouding tussen de beoogde maximum inspringen kracht en de cantilever veerconstante zijn. Zodra de afbuigsignaal de ingestelde maximale waarde heeft bereikt, wordt de cantilever vervolgens teruggetrokken uit de cel naar punt d, waar het vaak naar beneden worden getrokken als gevolg van tip-sample adhesie, los van de cel en keert terug naar zijn oorspronkelijke locatie bij e. Het rechter paneel toont de relatie tussen de inkeping en de opgenomen z en d signaal. In op de lagere linker paneel is een plot van een representatieve kracht curve, de maximale inspringen van een cantilever, waarvan de veerconstante wordt gemeten om te 0.07N / m, is ingesteld om 17 nm, zodat de maximale inspringen kracht toegepast op steekproef is 1.2 nN. De belangrijkste locaties tijdens de insprong zijn gemarkeerd.

Protocol

1. Kalibreer het voorjaar Constant van Cantilever Laad de cantilever in de AFM volgens de instructies van de fabrikant. Het is noodzakelijk om de cantilever houder schoon met ethanol voordat experimenten. Dit zal helpen bacteriële besmetting tijdens de AFM metingen te beperken tot cultuur. Kalibreren InvOLS (Inverse Optical Lever Gevoeligheid). Deze parameter beschrijft de hoeveelheid fotodiode response (Volt) per nanometer cantilever doorbuiging. Laad een schoon glasplaatje op het monste…

Representative Results

Figuur 2a toont drie representatieve krachtcurven uit 3T3 fibroblasten gekweekt op plastic oppervlak, polyacrylamide gel elasticiteitsmoduli 3000 Pa en 17.000 Pa, respectievelijk. Na zorgvuldig identificeren van de contactpunten in de bochten, wordt het inspringen kracht als functie van de cel vervorming uitgezet in Figuur 2b. Onder een kracht van grootte kleiner dan 0,3 nN, een piramidevorm tip streepjes 3 micrometer in een cel gekweekt op een 3 kPa polyacrylamidegel. In tegenstelling,…

Discussion

De AFM inspringen methode heeft voordelen om mechanische eigenschappen van levende cellen te karakteriseren. Zij het ​​minder gevoelig is dan de magnetische draaiende cytometrie en optische pincetten, welke krachten kunnen meten op het piconewton level ^32, kan de AFM weerstandskracht detecteren van monsters, variërend van enkele tientallen pico-Newton tot honderden nano-Newton, vergelijkbaar met variëren van kracht die kunnen worden toegepast op cellen met behulp van een micropipet ^19. Deze r…

Materials

Atomic Force Microscope

Asylum Research

MFP3D-BIO