Mesurer les propriétés mécaniques des cellules vivantes par microscopie à force atomique

Summary

Cet article démontre un protocole pour caractériser les propriétés mécaniques des cellules vivantes au moyen de microindentation aide d'un microscope à force atomique (AFM).

Abstract

Les propriétés mécaniques des cellules et la matrice extracellulaire (MEC) jouent un rôle important dans de nombreux processus biologiques, y compris la différenciation des cellules souches, la formation de tumeurs, et la cicatrisation des plaies. Les changements de raideur des cellules et ECM sont souvent des signes de changements dans la physiologie ou de maladies dans les tissus cellulaires. Par conséquent, la rigidité de la cellule est un indice pour évaluer l'état de cultures de cellules. Parmi la multitude de méthodes utilisées pour mesurer la rigidité des tissus et cellules, micro-indentation en utilisant un microscope à force atomique (AFM) fournit un moyen de mesurer de façon fiable la rigidité des cellules vivantes. Cette méthode a été largement appliquée pour caractériser la rigidité micro-échelle pour une variété de matériaux allant des surfaces métalliques dans les tissus et les cellules biologiques mous. Le principe de base de cette méthode est de mettre en retrait une cellule avec une pointe AFM de la géométrie sélectionnée et mesurer la force appliquée à partir de la flexion du cantilever AFM. Montage de la courbe force-indentation sur le mode Hertzl pour la géométrie de la pointe correspondante peut donner des mesures quantitatives de la rigidité du matériau. Cet article démontre la procédure pour caractériser la rigidité des cellules vivantes à l'aide de l'AFM. Les étapes clés, y compris le processus de calibration AFM, l'acquisition de force courbe, et l'analyse de données en utilisant une routine MATLAB sont démontrés. Les limites de cette méthode sont également discutés.

Introduction

Propriétés mécaniques, notamment la raideur, des cellules individuelles et leurs matrices extracellulaires environnantes (ECM) sont essentielles pour de nombreux processus biologiques, y compris la croissance cellulaire, la motilité, la division, la différenciation et l'homéostasie tissulaire. ¹ Il a été démontré que les cellules rigidité mécanique est principalement déterminée par le cytosquelette, en particulier les réseaux de filaments d'actine et intermédiaires et d'autres protéines associées. ² Les résultats des essais mécaniques sur des réseaux in vitro des filaments d'actine et intermédiaires suggèrent que les mécanismes cellulaires est largement dépendante de la structure du cytosquelette et la précontrainte dans le cytosquelette. ^3-5 Rigidité de cellules vivantes est alors considéré comme un indice pour évaluer la structure du cytosquelette ^6, l'activité myosine ⁷ et de nombreux autres processus cellulaires. Plus important encore, les changements dans les propriétés mécaniques cellulaires sont également souvent considérés comme étroitement associésATED avec diverses maladies telles que la formation de tumeurs et des métastases ^8-10 Contrôle de la rigidité mécanique des cellules vivantes peut donc fournir un nouveau moyen de contrôler la physiologie cellulaire;. pour détecter et diagnostiquer les maladies ^8;. et d'évaluer l'efficacité des traitements médicamenteux ^{11 , 12}

Plusieurs méthodes, y compris microrheologie de traces de particules, ^13-16 cytométrie de torsion magnétique, ¹⁷ micropipette aspiration ^18,19 et microindentation ^20-22 ont été développés pour mesurer l'élasticité des cellules. microrheologie de suivi des particules retrace les vibrations thermiques soit des particules fluorescentes submicroniques injectés dans des cellules ou des marqueurs fiduciaires à l'intérieur du cytosquelette de la cellule. ²³ propriétés élastiques et visqueuses de cellules sont calculés à partir des déplacements des particules mesurées en utilisant le théorème de fluctuation-dissipation. ^14,23 Cette méthode permet mesures simultanées de locauxpropriétés mécaniques à haute résolution spatiale à différents endroits dans une cellule. Cependant, l'injection de particules fluorescentes dans les cellules peut entraîner des changements dans la fonction cellulaire, la structure du cytosquelette, et donc les mécaniciens cellulaires. Procédé d'aspiration par micropipette applique une pression négative dans la micropipette de diamètre allant de 1 à 5 um d'aspirer un petit morceau de membrane de la cellule dans la pipette. la rigidité de la cellule est calculée à partir de la pression négative appliquée et de la déformation de la membrane cellulaire. ¹⁸ Cette méthode, cependant, ne peut pas détecter la distribution hétérogène de la rigidité à travers la cellule. La cytométrie en torsion magnétique (MTC) s'applique champ magnétique pour générer un couple sur des billes paramagnétiques super-attachés à la membrane cellulaire. ¹⁷ raideur cellulaire est dérivée de cette méthode à partir de la relation entre le couple appliqué et de la déformation de torsion de la membrane cellulaire. Il est difficile de contrôler l'emplacement des billes magnétiques dans la méthode MTC, et il est également challenging pour caractériser la déformation en torsion avec une grande résolution. Microindentation applique une indentation avec une géométrie bien définie de punch dans la cellule. La force de pénétration et le retrait résultant dans des cellules suivent souvent la prédiction du modèle Hertz. Des modules de Young de cellules peut être calculée à partir des courbes force-indentation en les équipant le modèle Hertz. Cette méthode a été largement appliquée pour tester les propriétés mécaniques des tissus et des cellules en dépit de ses limitations telles que l'incertitude dans la détermination du point de contact, l'applicabilité du modèle Hertz, et le potentiel d'endommager physiquement les cellules. Parmi les nombreux dispositifs pour microindentaion ^20, le microscope à force atomique (AFM) est disponible dans le commerce et a été largement appliquée pour caractériser les propriétés mécaniques des cellules et des tissus vivants ^21,24-27.

Cet article démontre la procédure d'utilisation d'un asile MFP3D-Bio AFM pour caractériser les mécanismes cellulaires. AFM pas surment fournit une topographie à haute résolution de cellules, mais aussi a été largement appliquée pour caractériser les propriétés mécaniques des cellules des tissus. Le principe de l'AFM indentation est illustrée à la figure 1. Le cantilever AFM se rapproche de la cellule à partir de quelques micromètres ci-dessus; entre en contact avec la cellule; tirets la cellule de sorte que la déviation en porte à faux atteigne une valeur de consigne présélectionnée, et se détache de la cellule. Au cours de ce processus, la déviation du cantilever est enregistrée en fonction de sa position comme indiqué sur la figure 1. Avant de prendre contact avec la cellule, la console se déplace dans le milieu sans aucune déviation apparente. Lorsque l'indentation sur la cellule, les coudes en porte à faux et le signal déviation augmente. Les leviers sont modélisés comme des poutres élastiques de telle sorte que leur déviation est proportionnelle à la force appliquée à la cellule. En réglant la déformation maximale en porte à faux, l'amplitude maximale de la force appliquée à l'échantillon est limitée pour éviter dAmage aux cellules. La portion de la courbe de force du point B au point C de la figure 1, où les tirets de pointe dans la cellule, n'est pas propre au modèle hertz pour extraire la rigidité de la cellule.

Figure 1. Illustration de l'AFM microindentation et l'interprétation de la courbe de force. Le panneau supérieur montre le mouvement de l'AFM cantilever entraîné par le scanner piezo. La position verticale Z du cantilever et la déviation en porte à faux signal D est enregistrée au cours du processus. Le porte à faux commence à partir du point A, de quelques microns au dessus de la cellule. En se rapprochant de la cellule, l'échantillon indentation δ reste nulle jusqu'à ce qu'il atteigne le point B, où la pointe est en contact avec la cellule. Les coordonnées du point B dans le complot sont des valeurs critiquespour l'analyse de données, notée (z _0, n _0>). De B ​​à C, les tirets en porte à faux dans la cellule jusqu'à ce que la déflection du cantilever atteint un point de consigne, qui est défini comme le rapport entre la force de pénétration maximale ciblée et la constante de ressort cantilever. Une fois le signal de déviation atteint la valeur maximale prédéterminée, le cantilever est alors retiré de la cellule à un point d, où elle souvent être tiré vers le bas en raison de pointe-échantillon adhésion, se détache de la cellule et revient à sa position initiale à e. Le panneau de droite illustre la relation entre le retrait et le z enregistrée et le signal d. Dans la partie inférieure gauche est un tracé d'une courbe représentative de la force, l'indentation maximum d'un porte à faux, dont la constante de ressort est mesurée comme étant de 0.07N / m, est réglé pour être 17 nm de telle sorte que la force maximale indentation appliquée à l'échantillon est de 1,2 nn. Les endroits clés au cours de l'indentation sont marquées.

Protocol

1. Calibrer la constante de ressort cantilever Chargez le cantilever dans le AFM conformément aux instructions du fabricant. Il est nécessaire de nettoyer le support en porte à faux avec de l'éthanol avant toute expérimentation. Cela permettra de limiter la contamination bactérienne de la culture au cours des mesures AFM. Calibrer InvOLS (Inverse Sensibilité de levier optique). Ce paramètre décrit la quantité de réponse de la photodiode (Volts) par nanomètre de déflection du cantile…

Representative Results

Figure 2a montre trois courbes de force représentatifs prélevés à partir de fibroblastes 3T3 cultivées sur une surface en plastique, gel de polyacrylamide des modules 3000 Pa de Young et 17.000 Pa, respectivement. Après identifiant soigneusement les points de contact dans les courbes, la force de pénétration en fonction de la déformation de la cellule est représentée sur la figure 2b. Sous une force de magnitude inférieure à 0,3 nN, une pyramide pleine forme, alinéas 3 mic…

Discussion

La méthode d'indentation AFM a des avantages pour caractériser les propriétés mécaniques des cellules vivantes. Quoique moins sensible que la cytométrie de torsion magnétique et pinces optiques, qui peuvent mesurer des forces sur le plan piconewton ^32, l'AFM permet de détecter la force de résistance à partir d'échantillons allant de quelques dizaines de pico-Newton à des centaines de nano-Newton, comparables à aller de force peut être appliqué à des cellules à l'aide d'une…

Materials

Atomic Force Microscope

Asylum Research

MFP3D-BIO