Измерение механических свойств живых клеток с помощью атомно-силовой микроскопии

Summary

Эта статья демонстрирует протокол для характеристики механических свойств живых клеток с помощью микроиндентирования с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ).

Abstract

Механические свойства клеток и внеклеточного матрикса (ECM) играют важную роль во многих биологических процессах, включая дифференцировку стволовых клеток, образование опухолей, и заживление ран. Изменение жесткости клеток и ECM часто являются признаками изменения в физиологии клеток или заболеваний в тканях. Таким образом, жесткость элемент является индексом для оценки состояния клеточных культур. Среди множества методов, применяемых для измерения жесткость клеток и тканей, микро-отступа использованием атомно-силового микроскопа (АСМ) обеспечивает возможность надежного измерения жесткость живых клеток. Этот способ широко применяется для описания микро-масштабе жесткости для различных материалов, начиная с металлических поверхностей мягкой биологической ткани и клетки. Основной принцип этого метода является создание отступа ячейки с иглой АСМ выбранной геометрии и измерения приложенной силы от изгиба кантилевера АСМ. Установка силового отступы кривой в режим Hertzл для соответствующей геометрии наконечника может дать количественные измерения жесткости материала. Эта статья демонстрирует процедуру для характеристики жесткости живых клетках с помощью АСМ. Ключевые шаги в том числе процесс калибровки АСМ, сила-кривой приобретения, а также анализ данных с использованием обычного MATLAB демонстрируются. Ограничения этого метода также обсуждаются.

Introduction

Механические свойства, особенно жесткости отдельных клеток и окружающей их внеклеточного матрикса (ECM) являются критическими для многих биологических процессов, в том числе рост клеток, подвижность, деление, дифференцировку и тканевого гомеостаза. ¹ Было показано, что клетки механическую жесткость в основном определяется цитоскелета, особенно сетей актина и промежуточных филаментов и других белков, связанных с ними. ² Результаты механических испытаний на сетях в пробирке актина и промежуточных филаментов предполагают, что клетки механика во многом зависит от структуры цитоскелета и предварительного напряжения в цитоскелета. ^3-5 Жесткость живых клеток затем рассматривается в качестве индекса для оценки структуры цитоскелета, ^{6, 7} активность миозина и многих других клеточных процессов. Более того, изменения в клеточной механические свойства также часто оказывается тесно свяated с различными условиями заболеваний, таких как образование опухолей и метастазов ^8-10 мониторинга механической жесткости живые клетки, следовательно, обеспечить новый способ контроля клеточной физиологии;. для обнаружения и диагностики заболеваний ^8;. а также для оценки эффективности медикаментозного лечения ^{11 , 12}

Несколько методов, включая частицы отслеживания микрореология, ^13-16 магнитный цитометрии скручивание, ¹⁷ микропипетки стремление ^18,19 и микроиндентирования ^20-22 были разработаны для измерения эластичности клеток. Микрореология отслеживания частиц прослеживает тепловых колебаний либо флуоресцентные частицы субмикронного вводили в клетки или координатных меток внутри клетки цитоскелета. ⁺²³ Упругих и вязких свойств клеток рассчитывается из измеренного смещения частиц использованием ФДТ. ^14,23 Этот метод позволяет одновременных измерений местныхмеханических свойств с высоким пространственным разрешением в разных местах в клетке. Тем не менее, инъекционное флуоресцентные частицы в клетки может привести к изменению клеточной функции, структуры цитоскелета, и, следовательно, клетки механики. Метод микропипетки пронизывает отрицательного давления в микропипетки с диаметром в диапазоне от 1 до 5 мкм, чтобы сосать небольшой кусок клеточную мембрану в пипетку. Сотовые жесткость рассчитывают из прикладной отрицательное давление и клеточные мембраны деформации. ¹⁸ Этот метод, однако, не может обнаружить неоднородное распределение жесткость по всей клетке. Магнитные цитометрии скручивание (ВТС) применяется магнитное поле для создания крутящего момента на супер шарики парамагнитный прикреплен к клеточной мембране. ¹⁷ сотовый жесткости происходит в этом методе из соотношения между приложенным крутящий момент и крутящий деформации клеточной мембраны. Это трудно контролировать расположение магнитных шариков в методе МТС, и это также challengiнг охарактеризовать деформация кручения с высоким разрешением. Микроиндентирования относится индентора с четко определенными геометрии пробить в клетку. Отступов силы и в результате углубление в клетках часто следуют предсказания модели Герца. Модуль Юнга клеток, может быть рассчитана по силе отступа кривые путем установки их в герцах модели. Этот способ широко применяется для проверки механических свойств тканей и клеток, несмотря на его ограничения, такие как неопределенность в точке контакта определение, применимость модели Герца, а также возможность физически повредить клетки. Среди многих устройствах для microindentaion ^20, атомно-силовой микроскоп (АСМ) является коммерчески доступной и широко применяется для характеристики механических свойств живых клетках и тканях ^21,24-27.

Эта статья демонстрирует порядок использования Asylum MFP3D-Bio AFM охарактеризовать клетку механики. AFM не налы обеспечивает высокое разрешение топографию элементов, но и широко применяется для характеристики механических свойств клеток ткани. Принцип отступа АСМ показано на рисунке 1. АСМ кантилевера приближается клетку от нескольких микрометров выше; вступает в контакт с клеткой; отступы ячейки таким образом, чтобы отклонение кантилевера достигает заданной уставки, и отрывается от клетки. Во время этого процесса изгиба кантилевера записывается в виде функции его расположения, как показано на рисунке 1. , Прежде чем связаться с клеткой, кантилевера движется в среде без видимых отклонений. Когда отступа на клетку, кантилевер изгибам и увеличивает отклонение сигнала. Кантилеверов смоделированы как упругих стержней так, чтобы их отклонение пропорционально силе, приложенной к ячейке. Установив максимальный прогиб кантилевера, максимальная величина силы, приложенной к образцу ограничено, чтобы избежать гAmage к клеткам. Часть силовой кривой из точки В в точку С на рисунке 1, где кончик отступы в клетку, не благонадежен для модели Герца, чтобы извлечь клетки жесткость.

Рисунок 1. Иллюстрация AFM микроиндентирования и интерпретация кривой усилия. Верхней панели показано движение кантилевера АСМ обусловлен сканер пьезо. Вертикальное расположение консольные г и изгиба кантилевера сигнал г записывается в ходе процесса. Консольные начинается от точки, в несколько микрометров выше клетку. При приближении к клетке, δ образец отступа остается равным нулю, пока не достигнет точки В, где кончик входит в контакт с клеткой. Координаты точки B в сюжете критические значениядля анализа данных, обозначаемых (Z _0, D _0>). От В к С, кантилевер отступы в клетку до изгиба кантилевера не достигает заданного значения, которое установлено, что соотношение между целевой максимальный отступа силы и жесткости кантилевера. После отклонения сигнала достигает заданного максимального значения, консольные затем удаляется из клетки к точке D, где она часто вырваться вниз под зонд-образец адгезия, отделяется от клетки и возвращается на прежнее место при Е. На правой панели показана взаимосвязь между углублением и записанного г и г сигнала. В левой нижней панели представляет собой график кривой, силы, максимальный отступ консольные, из которых пружины измеряется быть 0.07N / м, установлен на уровне 17 нм так, чтобы максимальное отступов силы, приложенной к образец 1,2 NN. Ключевые места во время отступа будут отмечены.

Protocol

1. Калибровка жесткость пружины кантилевера Загрузка кантилевера АСМ в соответствии с инструкциями производителя. Это необходимо очистить держатель зонда с этанолом перед любым экспериментов. Это поможет ограничить бактериальное загрязнение к культуре во время измерений АСМ. <…

Representative Results

На рисунке 2а три представителя силовые кривые взяты из фибробластов 3T3 культивировали на пластиковой поверхности, полиакриламидном геле модулей Юнга 3000 Па и 17000 Па соответственно. После тщательного выявления точек контакта в кривые, отступов силы как функция деформации ячей?…

Discussion

Метод АСМ углубление имеет преимущества, чтобы охарактеризовать механические свойства живых клеток. Хотя и менее чувствительны, чем магнитные цитометрии скручивания и оптический пинцет, который может измерить силы на уровне piconewton ^32, АСМ может обнаружить силы сопротивления из о?…

Materials

Atomic Force Microscope

Asylum Research

MFP3D-BIO