Medición de las propiedades mecánicas de las células vivas mediante microscopía de fuerza atómica

Summary

Este documento demuestra un protocolo para caracterizar las propiedades mecánicas de las células vivas por medio de microindentación utilizando un Microscopio de Fuerza Atómica (AFM).

Abstract

Las propiedades mecánicas de las células y la matriz extracelular (ECM) desempeñan papeles importantes en muchos procesos biológicos, incluyendo la diferenciación de células madre, la formación del tumor, y la cicatrización de heridas. Los cambios en la rigidez de las células y ECM son a menudo signos de cambios en la fisiología celular o enfermedades en los tejidos. Por lo tanto, la rigidez de células es un índice para evaluar el estado de los cultivos celulares. Entre la multitud de métodos aplicados para medir la rigidez de las células y tejidos, micro-indentación usando un Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) proporciona una manera de medir de forma fiable la rigidez de las células vivas. Este método ha sido aplicado ampliamente para caracterizar la rigidez de micro-escala para una variedad de materiales que van desde superficies metálicas a los tejidos biológicos blandos y células. El principio básico de este método es para sangrar una célula con una punta de AFM de la geometría seleccionada y medir la fuerza aplicada a partir de la flexión del cantilever de AFM. Montaje de la curva fuerza-sangría para el modo de Hertzl para la geometría de la punta correspondiente puede dar mediciones cuantitativas de la rigidez del material. En este trabajo se demuestra el procedimiento para caracterizar la rigidez de las células vivas utilizando AFM. Se demuestran los pasos clave, incluyendo el proceso de calibración de AFM, la adquisición de la fuerza de la curva, y el análisis de datos mediante una rutina de MATLAB. También se discuten las limitaciones de este método.

Introduction

Las propiedades mecánicas, especialmente la rigidez, de células individuales y sus matrices extracelulares que rodean (ECM) son fundamentales para muchos procesos biológicos, incluyendo el crecimiento celular, la motilidad, la división, diferenciación, y la homeostasis del tejido. ¹ Se ha demostrado que la rigidez mecánica de células está determinada principalmente por el citoesqueleto, especialmente las redes de actina y filamentos intermedios y otras proteínas asociadas con ellos. ² Los resultados de ensayos mecánicos sobre en redes in vitro de actina y filamentos intermedios sugieren que la mecánica de células es dependiente en gran medida de la estructura del citoesqueleto y la pre-tensión en el citoesqueleto. ^3-5 Rigidez de células vivas se considera entonces como un índice para evaluar la estructura del citoesqueleto ^6, la actividad de la miosina ⁷ y muchos otros procesos celulares. Más importante aún, los cambios en las propiedades mecánicas de células también se encuentran a menudo para ser estrechamente asociadosocasionada por la diversas condiciones de enfermedad, tales como la formación de tumores y la metástasis ^8-10 Control de la rigidez mecánica de las células vivas por lo tanto, puede proporcionar una nueva manera de controlar la fisiología celular;. para detectar y diagnosticar enfermedades ^8;., y para evaluar la eficacia de los tratamientos farmacológicos ^{11 , 12}

Múltiples métodos incluyendo microrheology partícula de seguimiento, ^13-16 magnética citometría de torsión, ¹⁷ micropipeta aspiración ^18,19 y microindentación ^20-22 se han desarrollado para medir la elasticidad de las células. Partículas microrheology seguimiento rastrea las vibraciones térmicas de cualquiera de las partículas fluorescentes submicrométricos inyectados en células o marcadores de referencia dentro del citoesqueleto celular. ²³ propiedades elásticas y viscosas de células se calculan a partir de los desplazamientos de partículas medidos utilizando el teorema de fluctuación-disipación. ^14,23 Este método permite mediciones simultáneas de localespropiedades mecánicas con alta resolución espacial en distintos lugares de una célula. Sin embargo, la inyección de partículas fluorescentes en las células puede conducir a cambios en la función celular, la estructura del citoesqueleto, y por lo tanto la mecánica celular. El método de aspiración con micropipeta se aplica presión negativa en una micropipeta de diámetro varía de 1 a 5 micras para aspirar una pequeña pieza de membrana celular en la pipeta. Rigidez celular se calcula a partir de la presión negativa aplicada y la deformación de la membrana celular. ¹⁸ Este método, sin embargo, no puede detectar la distribución heterogénea de la rigidez a través de la célula. Citometría de torsión magnética (MTC) se aplica el campo magnético para generar par de torsión sobre perlas de súper paramagnéticas unidas a la membrana celular. ¹⁷ rigidez célula se deriva en este método a partir de la relación entre el par aplicado y la deformación de torsión de la membrana celular. Es difícil controlar la ubicación de perlas magnéticas en el método de MTC, y también es challenging para caracterizar la deformación de torsión con alta resolución. Microindentación se aplica un penetrador con una geometría bien definida para perforar en la célula. La fuerza de penetración y la indentación resultante en las células a menudo siguen la predicción del modelo de Hertz. Módulos de Young de las células se puede calcular a partir de las curvas de fuerza-indentación ajustándolas al modelo de Hertz. Este método ha sido ampliamente aplicado para probar las propiedades mecánicas de los tejidos y las células a pesar de sus limitaciones, tales como la incertidumbre en la determinación del punto de contacto, la aplicabilidad del modelo de Hertz, y el potencial para dañar físicamente las células. Entre los muchos dispositivos para microindentaion ^20, el Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) está disponible comercialmente y se ha aplicado ampliamente para caracterizar las propiedades mecánicas de las células y tejidos vivos ^21,24-27.

En este trabajo se demuestra el procedimiento de utilizar un asilo MFP3D-Bio AFM para caracterizar la mecánica celular. AFM no enLY proporciona topografía de alta resolución de las células, pero también se ha aplicado ampliamente para caracterizar las propiedades mecánicas de las células del tejido. El principio de AFM indentación se ilustra en la Figura 1. El cantilever de AFM se aproxima a la célula desde unos pocos micrómetros más arriba; hace contacto con la célula; guiones la célula de modo que la deflexión voladizo alcanza un punto de consigna preseleccionado, y se aleja de la célula. Durante este proceso, la deflexión en voladizo se registra como una función de su ubicación, como se muestra en la Figura 1. Antes de hacer contacto con la célula, el voladizo se mueve en el medio sin ninguna desviación aparente. Cuando sangría en la célula, las curvas en voladizo y se incrementa la señal de deflexión. Los voladizos se modelan como vigas elásticas para que su desviación es proporcional a la fuerza aplicada a la célula. Al establecer la deflexión máxima en voladizo, la máxima magnitud de la fuerza aplicada a la muestra es limitada para evitar dNingún daño a las células. La porción de la curva de fuerza desde el punto B al punto C en la Figura 1, donde los guiones punta en la célula, se adaptan al modelo de hercios para extraer la rigidez celular.

Figura 1. Ilustración de la AFM microindentación e interpretación de la curva de fuerza. El panel superior muestra el movimiento de la AFM voladizo accionada por el escáner piezoeléctrico. La ubicación vertical del voladizo z y la deflexión en voladizo señal d se registra durante el proceso. El voladizo se inicia desde el punto a, unos pocos micrómetros por encima de la celda. Al acercarse a la célula, la muestra δ indentación permanece en cero hasta que se alcanza el punto B, donde la punta entra en contacto con la célula. Las coordenadas del punto b en el diagrama son valores críticospara el análisis de datos, que se denota por (z _0, d _0>). De B ​​a C, los guiones en voladizo en la célula hasta que la deflexión voladizo llega a un punto de ajuste, que se ajusta para que sea la relación entre la fuerza de penetración máxima al final del voladizo y la constante del resorte. Una vez que la señal de deflexión alcanza el valor máximo prefijado, el voladizo se retira entonces de la célula al punto d, donde a menudo ser tirado hacia abajo debido a la adhesión de la punta-de la muestra, se separa de la célula y vuelve a su ubicación inicial en el correo. El panel de la derecha ilustra la relación entre la indentación y la z grabada y la señal d. En en el panel inferior izquierdo es un gráfico de una curva representativa fuerza, la indentación máximo de un voladizo, de que la constante del resorte se mide a ser 0.07N / m, se ajusta para que sea 17 nm de manera que la fuerza máxima aplicada a la sangría muestra es 1,2 nN. Los puntos clave durante el sangrado se marcan.

Protocol

1. Calibrar la constante del resorte del voladizo Cargar el voladizo en el AFM de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Es necesario limpiar el soporte voladizo con etanol antes de cualquier experimento. Esto ayudará a limitar la contaminación bacteriana de la cultura durante las mediciones de AFM. Calibrar InvOLS (Inverse Sensibilidad palanca óptica). Este parámetro describe la cantidad de respuesta de fotodiodo (voltios) por nanómetro de deflexión voladizo. Cargar un portao…

Representative Results

La Figura 2a muestra tres curvas de fuerza representativas tomadas a partir de fibroblastos 3T3 cultivadas en la superficie de plástico, gel de poliacrilamida de los módulos de Young 3000 Pa y 17.000 Pa, respectivamente. Después de identificar cuidadosamente los puntos de contacto en las curvas, la fuerza de penetración en función de la deformación celular se representa en la Figura 2b. Bajo una fuerza de magnitud menor que 0,3 nN, una forma de pirámide guiones punta 3 micrómetr…

Discussion

El método de indentación AFM tiene ventajas para caracterizar las propiedades mecánicas de las células vivas. Aunque menos sensible que la citometría de torsión magnético y pinzas ópticas, que puede medir fuerzas en el nivel picoNewton ^32, el AFM puede detectar la fuerza de resistencia de las muestras que van desde decenas de pico-Newton a cientos de nano-Newton, comparable a la gama de la fuerza que se puede aplicar a las células utilizando una micropipeta ^19. Este rango de la fuerza se a…

Materials

Atomic Force Microscope

Asylum Research

MFP3D-BIO