Mätning av mekaniska egenskaper i levande celler Använda Atomkraftsmikroskopi

Summary

Detta dokument visar ett protokoll för att karakterisera de mekaniska egenskaperna hos levande celler genom mikrointryckt använder ett atomkraftsmikroskop (AFM).

Abstract

Mekaniska egenskaper hos celler och extracellulär matris (ECM) spelar viktiga roller i många biologiska processer inklusive stamceller differentiering, tumörbildning, och sårläkning. Förändringar i styvhet av celler och ECM är ofta tecken på förändringar i cellens fysiologi eller sjukdomar i vävnader. Därför är cell stelhet ett index för att utvärdera statusen av cellkulturer. Bland de många metoder som används för att mäta styvheten hos celler och vävnader, ger mikro-indrag använder ett atomkraftsmikroskop (AFM) ett sätt att tillförlitligt mäta styvheten hos levande celler. Denna metod har i stor utsträckning för att karakterisera den mikroskala styvhet för en mängd olika material, från metallytor för att mjuka biologiska vävnader och celler. Den grundläggande principen för denna metod är att dra in en cell med en AFM spets vald geometri och mäta den applicerade kraften från böjningen av AFM fribärande. Montering av kraft-indrag kurva till Hertz-lägetl för motsvarande spets geometri kan ge kvantitativa mätningar av material styvhet. Denna uppsats visar proceduren för att karakterisera styvheten hos levande celler med användning av AFM. Viktiga steg, inklusive arbetet med AFM kalibrering, kraft-kurvan förvärv, och data analys med en MATLAB rutin demonstreras. Begränsningar av denna metod diskuteras också.

Introduction

Mekaniska egenskaper, särskilt styvhet, i enskilda celler och deras omgivande extracellulära matriser (ECM) är kritisk för många biologiska processer, inklusive celltillväxt, motilitet, division, differentiering, och vävnad homeostas. ¹ Det har visats att celler mekanisk styvhet i huvudsak bestäms av cytoskeletonen, särskilt de nätverk av aktin och intermediära filament och andra proteiner associerade med dem. ² Resultat från mekaniska tester på in vitro nätverk av aktin och intermediära filament antyder att cellen mekanik är i hög grad beroende av den cytoskeletal struktur och pre-stress i cytoskelettet. ^3-5 Styvhet av levande celler är sedan betraktas som ett index för att utvärdera cytoskelettala strukturen ^6, myosin aktivitet ⁷ och många andra cellulära processer. Ännu viktigare, är förändringar i cellernas mekaniska egenskaper också ofta visat sig vara nära intresseföretagpade med olika sjukdomstillstånd, såsom tumörbildning och metastas ^8-10 Övervakning mekanisk styvhet levande celler därför kan ge ett nytt sätt att övervaka cellens fysiologi;. att upptäcka och diagnostisera sjukdomar ^8,. samt att utvärdera effektiviteten av läkemedelsbehandling ^{11 , 12}

Flera metoder inklusive partikel-tracking microrheology, ^13-16 magnetisk vridning cytometri, ¹⁷ mikropipett aspiration ^18,19 och mikrointryckt ^20-22 har tagits fram för att mäta elasticiteten i cellerna. Particle tracking microrheology spårar termiska vibrationer av antingen submikrona fluorescerande partiklar injiceras i celler eller referensmärken markörer inuti cellen cytoskelettet. ²³ Elastiska och viskösa egenskaper hos celler är beräknade från de uppmätta partikel förskjutningar med hjälp av fluktuation-försvinnande sats. ^14,23 Denna metod medger samtidiga mätningar av lokalmekaniska egenskaper med hög rumslig upplösning på olika platser i en cell. Dock kan injicera fluorescerande partiklar i celler leda till förändringar i cellulär funktion, cytoskeleton struktur, och därmed även mekanik cell. Den mikropipett aspiration metoden gäller undertryck i en mikropipett med en diameter varierande från 1 till 5 um för att suga en liten bit av cellmembranet in i pipetten. Cell styvhet beräknas från den tillämpade undertryck och cellmembranet deformation. ¹⁸ Denna metod är dock inte kan detektera ojämn fördelning av stelhet över cellen. Magnetisk vridning cytometri (MTC) gäller magnetfält för att generera vridmoment på super paramagnetiska kulor fästa till cellmembranet. ¹⁷ Cell styvhet härleds i denna metod från sambandet mellan det applicerade momentet och den vridande deformation av cellmembranet. Det är svårt att kontrollera placeringen av magnetiska pärlor i MTC metoden, och det är också challenging att karakterisera vridande deformation med hög upplösning. Mikrointryckt tillämpar en indenter med väldefinierad geometri att stansa in i cellen. Den tandade kraft och den resulterande fördjupning i celler följer ofta förutsägelsen av Hertz modellen. Youngs moduler av celler kan beräknas ur kraft-indrag kurvor genom att montera dem till Hertz modellen. Denna metod har i stor utsträckning för att testa de mekaniska egenskaperna hos vävnader och celler trots av dess begränsningar såsom osäkerhet i kontaktpunkt bestämning, tillämpligheten av Hertz-modellen, och potentialen att fysikaliskt skada cellerna. Bland de många anordningar för microindentaion ^20, är den atomkraftsmikroskop (AFM) kommersiellt tillgängliga och har i stor utsträckning för att karakterisera mekaniska egenskaper hos levande celler och vävnader ^21,24-27.

Denna uppsats visar förfarandet med att använda en asyl-MFP3D-Bio AFM att karakterisera cell mekanik. AFM inte påly ger hög upplösning topografi av celler men också har i stor utsträckning för att karakterisera de mekaniska egenskaperna hos vävnadsceller. Principen för AFM fördjupning illustreras i figur 1. AFM fribärande närmar cellen från några få mikrometer uppåt, kommer i kontakt med cellen; strecksatserna cellen så att den fribärande avböjning når en förvald uppsättning punkt, och drar bort från cellen. Under denna process fribärande avböjning registreras som en funktion av dess läge som visas i figur 1. Innan kontakt med cellen, förflyttar fribärande i mediet utan någon påtaglig avböjning. När indrag på cellen, de böjer fribärande och deformationen ökar signal. De utliggare modelleras som elastiska balkar så att deras böjning är proportionell mot kraften som anbringas på cellen. Genom att ställa in den maximala fribärande böjning, är den maximala storleken på kraft på provet begränsas för att undvika dAmage till celler. Den del av den kraft kurvan från punkt B till punkt C i Fig. 1, där spetsen strecksatserna in i cellen, är lämplig att den hertz modellen att extrahera cellen styvhet.

Figur 1. Illustration av AFM mikrointryckt och tolkning av kraftkurvan. Den övre panelen visar rörelsen hos AFM fribärande driven av den piezo skannern. Den vertikala placeringen av fribärande z och den fribärande avböjningssignalen d registreras under processen. Den fribärande startar från punkt a, några mikrometer ovanför cellen. Samtidigt närmar cellen, förblir provet indrag δ noll tills den når punkt b, där spetsen kommer i kontakt med cellen. Koordinaterna för punkten B i komplotten är kritiska värdenför dataanalys, betecknat med (z _0, d _0>). Från B till C, konsolpartierna strecksatserna in i cellen tills den fribärande avböjning når ett börvärde, som är satt att vara kvoten mellan den riktade maximal indraget kraft och den fribärande fjäderkonstant. När avböjningssignalen når det förinställda maximala värdet är fribärande sedan bort från cellen till led d, där det ofta dras nedåt, på grund tip-prov vidhäftning, lossnar från cellen och återgår till sin ursprungliga plats på e. Den högra panelen visar förhållandet mellan fördjupningen och den inspelade z och d-signal. I den nedre vänstra panelen är en plot av en representativ kraftkurva den maximala fördjupningen av en konsol, där fjäderkonstanten mäts vara 0.07N / m, är inställd på att vara 17 nm så att den maximala indraget kraft tillämpas på provet är 1,2 nN. De viktigaste platserna under fördjupningen är markerade.

Protocol

Ett. Kalibrera fjäderkonstanten hos Cantilever Ladda fribärande i AFM enligt tillverkarens anvisningar. Det är nödvändigt att rengöra fribärande hållare med etanol innan några experiment. Detta kommer att bidra till att begränsa bakteriell kontamination till kultur under AFM mätningarna. Kalibrera InvOLS (Inverse Optical Lever Känslighet). Denna parameter beskriver mängden fotodiod respons (volt) per nanometer av fribärande böjning. Ladda en ren glasskiva på provet scenen, …

Representative Results

Figur 2a visar tre kurvor representativ kraft tas från 3T3-fibroblaster odlade på plastyta, polyakrylamidgel av Youngs moduler 3.000 Pa och 17.000 Pa, respektive. Efter att noggrant identifiera kontaktpunkter i kurvorna är indraget kraften som funktion av cellens deformation plottas i figur 2b. Under en kraft storleksordning mindre än 0,3 nN, pyramidform tips strecksatserna 3 mikrometer i en cell odlad på en 3 kPa polyakrylamidgel. Däremot är en kraft mer än 1,6 nN krävs att in…

Discussion

AFM indrag metod har sina fördelar att karakterisera mekaniska egenskaper hos levande celler. Än mindre känslig än den magnetiska vrida cytometry och optisk pincett, som kan mäta krafter på piconewton nivå ^32, kan AFM upptäcka motståndet kraft från prover som sträcker sig från tiotals pico-Newton till hundratals nano-Newton, jämförbara med allt våld som kan tillämpas på celler med användning av en mikropipett ^19. Denna serie av våld passar behoven att skapa mätbara deformationer…

Materials

Atomic Force Microscope

Asylum Research

MFP3D-BIO