En kvantitativ analyse til at studere Protein: DNA interaktioner, Discover transskriptionsregulatorer af genekspression, og identificere nye anti-tumor Agents
Summary
Vi har udviklet en kvantitativ DNA-bindende ELISA-assay til måling af transkriptionsfaktor interaktion med DNA. Høj specificitet for RUNX2 protein blev opnået med en konsensus DNA-genkendelse oligonukleotid og specifikt monoklonalt antistof. Kolorimetrisk detektion med et enzym-koblet antistof substrat Reaktionen blev overvåget i realtid.
Abstract
Mange DNA-bindende assays, såsom elektroforetisk mobilitet shift assays (EMSA), kemiluminescerende assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-baserede assays og multibrønds assays anvendes til at måle transkriptionsfaktoraktivitet. Men disse assays er nonquantitative mangler specificitet, kan involvere anvendelse af radioaktivt mærkede oligonucleotider og kan ikke tilpasses til screening af inhibitorer af DNA-bindende. På den anden side, ved hjælp af en kvantitativ DNA-bindende enzymkoblet immunosorbent assay (D-ELISA) assay demonstrerer vi nukleare interaktioner protein med DNA ved hjælp af RUNX2 transkriptionsfaktor, der afhænger af specifikke associering med konsensus DNA-bindende sekvenser til stede på biotin- mærkede oligonukleotider. Fremstilling af celler, ekstraktion af kerneprotein og design af dobbeltstrengede oligonucleotider beskrevet. Avidin-coatede 96-brønds plader er fastgjort med alkalisk buffer og inkuberet med kerneproteiner i nukleotid blokeringsbuffer. Follgrund omfattende vask af pladerne, bestemt primært antistof og sekundære antistofinkubationer efterfølges af tilsætning af peberrodsperoxidase substrat og udvikling af den kolorimetriske reaktion. Stop reaktionen mode eller kontinuerlig kinetisk kontrol blev anvendt til kvantitativt at måle protein-interaktion med DNA. Vi drøfte passende specificitet kontroller, herunder behandling med ikke-specifik IgG eller uden protein eller primære antistof. Anvendelser af assayet beskrevet herunder anvendelighed i lægemiddel-screening, og de repræsentative positive og negative resultater diskuteres.
Introduction
DNA-bindingsassays har anvendelighed til at måle evnen af transkriptionsfaktorer til at interagere med DNA. Assays for DNA bindende indbefatter elektroforetiske mobilitet shift assays (EMSA), som er afhængige af radioaktivt mærkede oligonukleotider 1 eller chemiluminescens assays 2. Kromatin immuneprecipitation (chip) baserede assays 3 samt analyser, der anvender 96-brønds formater 4 er også blevet beskrevet. Men EMSA er en ikke-kvantitativ analyse, der kræver brug af radiomærkede oligonukleotider. Når nukleare proteiner forbinder med de specifikke nukleotid promotorsekvenserne, bindende komplekser er retarderede på polyacrylamidgeler og den specifikke transskription faktor kan valideres med et antistof "supershift". Vi har udviklet en kvantitativ DNA-bindingsassay under anvendelse af et enzymbundet immunsorbentassay format (D-ELISA), som er i stand til at måle interaktionen af RUNX2 med DNA-bindende sekvenser svarende til definerede promotorelementer in RUNX2 målgener. Anvendelse af et anti-RUNX2 antistof giver specificitet til assayet og den manglende radiomærke skelne dette assay fra den traditionelle gel shift assay 5. Påvisning af bindende komplekser er muligt med anvendelse af et sekundært antistof koblet til peberrodsperoxidase (HRP), som omdanner et HRP-substrat, tetramethylbenzidin (TMB) til et farvet produkt til spektrofotometrisk analyse. Den her rapporterede assay kan inkorporere anvendelsen af muterede DNA-oligonukleotider som kontroller og kan anvendes til påvisning af konkurrerende eller ikke-konkurrerende inhibitorer af DNA bindende. Screeningen af hidtil ukendte anti-tumor-forbindelser er også muligt med dette assay.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA-bindende assays anvendes til at måle evnen af transkriptionsfaktorer til at interagere med DNA. Analyser for DNA bindende inkluderer elektroforetiske mobilitet shift (EMSA) 1 og kromatin immuneprecipitation (chip) baserede assays 3 samt analyser, der anvender 96-brønds formater 4 såsom kemiluminescerende assays 2. EMSA er ikke kvantitativ og bruger radioaktivt (32P) oligonukleotider. Disse inkuberes med kerneproteiner og bindende komplekser separeres p?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den tekniske bistand og instrumentering af University of Maryland Greenebaum Cancer Center Translationel Core Facility, især Drs. Rena Lapidus og Mariola Sadowska er taknemmeligt anerkendt. Værket er ansvarlig for udviklingen af denne analyse blev finansieret delvist af NIH RO1CA108846, AHA Grant-in-Aid GRNT2130014, en VA Merit Award til AP, og ved University of Maryland Cigaret Tilbagelevering Funds (CRF) leveres til Marlene & Stewart Greenebaum Cancer Center.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Poly dI/dC | GE Healthcare, Piscataway, NJ | US20539-5UN | 1 U ~50mg |
| RUNX2 antibody | MBL International Corp., Woburn, MA | D130-3 | 1 mg/ml |
| Fab-specific peroxidase conjugated antibody | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9917 | 7.1 mg/ml |
| TMB Substrate (tetramethyl benzidine) | EXALPHA Biologicals, Shirley, MA | X1189S | 100 ml |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 57995 | Plate-fixing |
| Sulfuric Acid | VWR, West Chester, PA | BDH-39922-1 | Stop solution |
| Multi-well plates | Greiner Bio-One, Basel, Switzerland | 655996 | Avidin-coated, black sides |
| HALT | Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL | 78440 | Protease and phosphatase inhibitors |
| Chemicals | Various manufacturers | Laboratory grade | |
| Table 1. Reagents | |||
| Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader | Amersham Biosciences | For use with stop reaction method | |
| Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader | Bio-Tek Instruments, Inc. | For use with continuous kinetic monitoring | |
| Table 2. Equipment |
References
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay. Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).
- Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays. BMC Genomics. 10, 497 (2009).
- Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses. FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).
- D’Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway. J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).
- Underwood, K. F., D’Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity. J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).
- Held, P. Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations. Biotek Instruments Application Note. , (2007).
- Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Res. 29, E21 (2001).
- Pommier, Y. DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).
- Pennisi, E. Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA. Science. 337, 1159-1161 (2012).
