Een Kwantitatieve Analyse naar Protein Studie: DNA interacties, Discover transcriptieregulatoren van genexpressie, en het identificeren van nieuwe anti-tumor Agents
Summary
We ontwikkelden een kwantitatieve DNA-bindende ELISA gebaseerde bepaling om transcriptiefactor interactie met DNA te meten. Hoge specificiteit voor de RUNX2 eiwit werd bereikt met een consensus DNA-herkenning oligonucleotide en specifieke monoklonale antilichaam. Colorimetrische detectie met een enzym-gekoppelde antilichaam substraat reactie werd gevolgd in real time.
Abstract
Vele DNA-bindende assays zoals elektroforetische mobiliteit shift assays (EMSA), chemiluminescente assays, chromatine immunoprecipitatie (ChIP)-gebaseerde testen en multiwell-gebaseerde bepalingen worden gebruikt om transcriptie factor activiteit te meten. Echter, deze tests zijn nonquantitative ontberen specificiteit, kan het gebruik van radioactief gemerkte oligonucleotiden omvatten, en kunnen niet aangepast voor het screenen van remmers van DNA-binding zijn. Anderzijds, toepassing van een kwantitatieve DNA-bindings-enzyme linked immunosorbent assay (D-ELISA) test tonen we eiwitinteracties kern met DNA met de RUNX2 transcriptiefactor die afhankelijk specifieke associatie met consensus-DNA-bindende sequenties aanwezig biotine- gelabelde oligonucleotiden. Voorbereiding van de cellen, de winning van nucleair eiwit, en het ontwerp van dubbelstrengs oligonucleotiden worden beschreven. Avidine gecoate 96-well platen zijn bevestigd met alkalische buffer en geïncubeerd met nucleaire eiwitten nucleotide blokkeerbuffer. Follwegens uitvoerig wassen van de platen, specifieke primair antilichaam en secundair antilichaam incubaties worden gevolgd door de toevoeging van mierikswortel peroxidase substraat en ontwikkeling van de colorimetrische reactie. Stop reactiewijze of continue kinetische controle werden gebruikt om kwantitatief te meten eiwit interactie met DNA. We bespreken geschikte specificiteit controles, waaronder behandeling met niet-specifiek IgG of eiwit of primaire antilichaam. Toepassingen van de test beschreven onder zijn nut in drug screening en representatieve positieve en negatieve resultaten worden besproken.
Introduction
DNA-bindende assays zijn nuttig bij het meten van het vermogen van transcriptiefactoren te interageren met DNA. Assays voor DNA-binding omvatten elektroforetische mobiliteit shift assays (EMSA) die afhankelijk zijn van radioactief gemerkte oligonucleotiden 1 of chemiluminescentie assays 2. Chromatine immuneprecipitation (ChIP) gebaseerde testen 3 en bepalingen waarbij 96-well formaat 4 zijn ook beschreven. De EMSA een niet-kwantitatieve test die het gebruik van radioactief gemerkte oligonucleotiden vereist. Wanneer nucleaire eiwitten associëren met de specifieke nucleotide promoter sequenties, bindende complexen zijn vertraagd op polyacrylamidegelen en de specifieke transcriptiefactor kunnen worden gevalideerd met een antilichaam "supershift". We hebben een kwantitatieve DNA bindingstest met behulp van een enzymgekoppelde immunosorbent formaat (D-ELISA), die in staat is de interactie van RUNX2 meten DNA-bindende sequenties die overeenkomen met bepaalde promoter elementen ontwikkeld in RUNX2 doelwit genen. Gebruik van een anti-RUNX2 antilichaam verschaft specificiteit voor de bepaling en het ontbreken van radiolabel onderscheiden deze assay uit de traditionele gel shift assay 5. Detectie van binding complexen is mogelijk met het gebruik van een secundair antilichaam gekoppeld aan mierikswortel peroxidase (HRP), die een HRP substraat tetramethylbenzidine (TMB) wordt omgezet in een gekleurd product voor spectrofotometrische analyse. De test hier vermeld kan het gebruik van gemuteerde DNA-oligonucleotiden als controles opgenomen en kan worden gebruikt voor de detectie van competitieve of niet-competitieve remmers van DNA-binding. Het screenen van nieuwe anti-tumor verbindingen is ook mogelijk met deze assay.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA-bindende assays worden gebruikt om het vermogen van transcriptiefactoren te interageren met DNA te meten. Voor DNA binding omvatten elektroforetische mobiliteit verschuiving (EMSA) 1 en chromatine immuneprecipitation (ChIP) gebaseerde testen 3 en bepalingen waarbij 96-well formaat 4 zoals chemiluminescente assays 2. Het EMSA is niet-kwantitatieve en maakt gebruik van radioactief gemerkt (32 P) oligonucleotiden. Deze worden geïncubeerd met nucleaire eiwitten en …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De technische bijstand en instrumentatie van de Universiteit van Maryland Greenebaum Cancer Center Translationeel Core Facility, vooral Drs. Rena Lapidus en Mariola Sadowska, worden bedankt. Het werk verantwoordelijk voor de ontwikkeling van deze test werd deels gefinancierd door NIH RO1CA108846, AHA Grant-in-Aid GRNT2130014, een VA Merit Award uit aan AP, en door de Universiteit van Maryland Cigarette Restitutie Funds (CRF) verstrekt aan de Marlene & Stewart Greenebaum Cancer Center.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Poly dI/dC | GE Healthcare, Piscataway, NJ | US20539-5UN | 1 U ~50mg |
| RUNX2 antibody | MBL International Corp., Woburn, MA | D130-3 | 1 mg/ml |
| Fab-specific peroxidase conjugated antibody | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9917 | 7.1 mg/ml |
| TMB Substrate (tetramethyl benzidine) | EXALPHA Biologicals, Shirley, MA | X1189S | 100 ml |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 57995 | Plate-fixing |
| Sulfuric Acid | VWR, West Chester, PA | BDH-39922-1 | Stop solution |
| Multi-well plates | Greiner Bio-One, Basel, Switzerland | 655996 | Avidin-coated, black sides |
| HALT | Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL | 78440 | Protease and phosphatase inhibitors |
| Chemicals | Various manufacturers | Laboratory grade | |
| Table 1. Reagents | |||
| Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader | Amersham Biosciences | For use with stop reaction method | |
| Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader | Bio-Tek Instruments, Inc. | For use with continuous kinetic monitoring | |
| Table 2. Equipment |
References
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay. Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).
- Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays. BMC Genomics. 10, 497 (2009).
- Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses. FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).
- D’Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway. J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).
- Underwood, K. F., D’Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity. J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).
- Held, P. Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations. Biotek Instruments Application Note. , (2007).
- Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Res. 29, E21 (2001).
- Pommier, Y. DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).
- Pennisi, E. Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA. Science. 337, 1159-1161 (2012).
