Un dosage quantitatif pour l'étude de protéines: ADN Interactions, Découverte de transcription régulateurs de l'expression des gènes, et identifier les agents anti-tumoraux
Summary
Nous avons développé, un dosage quantitatif liaison à l'ADN à base d'ELISA pour mesurer les interactions de facteurs de transcription à l'ADN. Une spécificité élevée pour la protéine de RUNX2 a été obtenue avec un consensus de l'ADN-oligonucléotide reconnaissance et l'anticorps monoclonal spécifique. Détection colorimétrique avec un substrat de réaction de l'anticorps couplé à une enzyme a été suivie en temps réel.
Abstract
De nombreux essais de liaison à l'ADN tels que les tests électrophorétique de décalage de mobilité (EMSA), des dosages chimioluminescents, immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) à base de tests et des analyses multi-puits-base sont utilisés pour mesurer l'activité du facteur de transcription. Cependant, ces tests sont non quantitative, manquent de spécificité, peuvent impliquer l'utilisation d'oligonucléotides radiomarqués, et peuvent ne pas être adaptable pour le dépistage des inhibiteurs de liaison à l'ADN. D'autre part, en utilisant un dosage quantitatif de liaison d'ADN immuno-enzymatique (D-ELISA), nous démontrons les interactions entre protéines nucléaires avec l'ADN en utilisant le facteur de transcription de RUNX2 qui dépendent de la liaison spécifique à des séquences de liaison à l'ADN consensus présents sur biotine- oligonucléotides marqués. Préparation de cellules, extraction de protéine nucléaire, et la conception des oligonucléotides bicaténaires sont décrits. Plaques de 96 puits revêtues d'avidine sont fixées avec du tampon alcalin et incubées avec des protéines nucléaires dans un tampon de blocage nucléotidique. Follen raison lavage extensif des plaques, un anticorps primaire spécifique et les incubations d'anticorps secondaires sont suivies par l'addition du substrat de la peroxydase de raifort et le développement de la réaction colorimétrique. mode de réaction d'arrêt ou suivi cinétique continue ont été utilisés pour mesurer quantitativement l'interaction de la protéine avec l'ADN. Nous discutons des contrôles de spécificité appropriées, y compris le traitement par IgG non spécifique ou sans protéines ou anticorps primaire. Les applications de l'essai sont décrits notamment son utilité dans le criblage de médicaments et les résultats positifs et négatifs représentatifs sont discutés.
Introduction
des dosages de liaison à l'ADN sont utiles dans la mesure de la capacité des facteurs de transcription pour interagir avec l'ADN. Les dosages pour l'ADN de liaison comprennent des dosages de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA) qui dépendent des oligonucleotides radiomarqués 1 ou 2 essais de chimioluminescence. Essais chromatine immuneprecipitation (ChIP) sur la base 3, ainsi que des tests employant des formats de 96 et 4 ont également été décrites. Cependant, l'EMSA est un essai non-quantitative qui nécessite l'utilisation d'oligonucléotides radiomarqués. Lorsque les protéines nucléaires associent à des séquences spécifiques de promoteur de nucléotides, complexes de liaison sont retardés sur des gels de polyacrylamide et le facteur de transcription spécifique puissent être validées par un anticorps "supershift". Nous avons développé un dosage de liaison à l'ADN quantitative en utilisant un format d'immuno-enzymatique (ELISA-D), qui est capable de mesurer l'interaction des RUNX2 avec des séquences de liaison à l'ADN correspondant à des éléments promoteurs définis igènes cibles de n RUNX2. Utilisation d'un anticorps anti-RUNX2 fournit la spécificité de l'essai et de l'absence de ce dosage radio-marqueur de distinction à partir de l'essai de décalage de gel traditionnel 5. La détection de complexes de liaison est possible avec l'utilisation d'un anticorps secondaire couplé à la peroxydase de raifort (HRP), qui convertit un substrat HRP, tétraméthyl benzidine (TMB) en un produit coloré pour l'analyse spectrophotométrique. L'analyse présentée ici peut intégrer l'utilisation d'oligonucléotides d'ADN mutées comme témoins et peut être utilisé pour la détection des inhibiteurs compétitifs ou non compétitifs de liaison à l'ADN. Le criblage de composés anti-tumoraux est également possible avec ce dosage.
Protocol
Representative Results
Discussion
des dosages de liaison à l'ADN sont utilisées pour mesurer la capacité des facteurs de transcription pour interagir avec l'ADN. Les dosages de liaison de l'ADN comprennent la mobilité électrophorétique (EMSA) et une chromatine immuneprecipitation (ChIP) essais basés 3 ainsi que des dosages utilisant des formats à 96 puits 4 tels que des dosages chimiluminescents 2. L'EMSA est non quantitative et utilise radiomarqué (32 P) oligonucléotides. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L'assistance technique et l'instrumentation de l'Université du Maryland Greenebaum Cancer Center translationnelle base installation, en particulier MM. Rena Lapidus et Mariola Sadowska, grandement appréciée. Le travail responsable de l'élaboration de cet essai a été financé en partie par les NIH RO1CA108846, AHA Grant-in-Aid GRNT2130014, un prix d'excellence VA à AP, et par l'Université de Maryland cigarettes fonds de restitution (CRF) fourni à la Marlene Stewart & Cancer Center Greenebaum.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Poly dI/dC | GE Healthcare, Piscataway, NJ | US20539-5UN | 1 U ~50mg |
| RUNX2 antibody | MBL International Corp., Woburn, MA | D130-3 | 1 mg/ml |
| Fab-specific peroxidase conjugated antibody | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9917 | 7.1 mg/ml |
| TMB Substrate (tetramethyl benzidine) | EXALPHA Biologicals, Shirley, MA | X1189S | 100 ml |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 57995 | Plate-fixing |
| Sulfuric Acid | VWR, West Chester, PA | BDH-39922-1 | Stop solution |
| Multi-well plates | Greiner Bio-One, Basel, Switzerland | 655996 | Avidin-coated, black sides |
| HALT | Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL | 78440 | Protease and phosphatase inhibitors |
| Chemicals | Various manufacturers | Laboratory grade | |
| Table 1. Reagents | |||
| Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader | Amersham Biosciences | For use with stop reaction method | |
| Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader | Bio-Tek Instruments, Inc. | For use with continuous kinetic monitoring | |
| Table 2. Equipment |
References
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