Eine quantitative Assay zur Protein Studie: DNA-Wechselwirkungen, Discover Transkriptionsregulatoren der Genexpression, und identifizieren Novel Anti-Tumor-Wirkstoffe
Summary
Wir entwickelten eine quantitative DNA-bindenden, ELISA-basierten Assay Transkriptionsfaktor-Interaktionen mit DNA zu messen. Hohe Spezifität für das RUNX2 Protein wurde mit einer Consensus-DNA-Oligonukleotid und Erkennung spezifischer monoklonaler Antikörper erreicht. Kolorimetrischen Nachweis mit einem Enzym-gekoppelten Antikörper Substrat-Reaktion wurde in Echtzeit überwacht.
Abstract
Viele DNA-Bindungsassays, wie elektrophoretische Mobilitätsverschiebungstests (EMSA), chemilumineszenten Assays Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)-basierte Assays und Multiwell-basierten Assays verwendet werden, um Transkriptionsfaktor-Aktivität zu messen. Allerdings sind diese Tests nicht-quantitative, fehlt die Spezifität, kann die Verwendung von radioaktiv markierten Oligonukleotide beinhalten und kann nicht für das Screening von Inhibitoren der DNA-Bindung anpassungsfähig sein. Auf der anderen Seite, unter Verwendung einer quantitativen DNA-bindende Enzyme-linked Immunosorbent Assay (D-ELISA-Test) zeigen wir, nukleäres Protein-Wechselwirkungen mit DNA unter Verwendung des RUNX2 Transkriptionsfaktor, der auf spezifische Assoziation mit Konsensus-DNA-Bindungssequenzen auf Biotin vorliegenden hängen markierte Oligonukleotide. Vorbereitung der Zellen, die Gewinnung von Kernprotein, und das Design der Doppelstrang-Oligonukleotiden beschrieben. Avidin-beschichteten 96-well Platten mit alkalischen Puffer fixiert und mit Kernproteinen in Nukleotid-Blockierungspuffer inkubiert. Folldurch ausgiebiges Waschen der Platten spezifischen primären Antikörper und sekundären Antikörper-Inkubationen werden durch die Zugabe von Meerrettich-Peroxidase-Substrat und der Entwicklung der Farbreaktion verfolgt. Stop-Reaktionsmodus oder kontinuierliche Überwachung kinetische wurden verwendet, um quantitativ zu messen Protein-Wechselwirkung mit DNA. Wir diskutieren entsprechende Spezifität Kontrollen, einschließlich der Behandlung mit nicht-spezifischen IgG-oder Protein oder ohne primären Antikörper. Anwendungen des Assays sind beschrieben, einschließlich ihrer Nützlichkeit in Wirkstoff-Screening und repräsentativen positiven und negativen Ergebnisse diskutiert.
Introduction
DNA-Bindungs-Assays sind nützlich bei der Messung der Fähigkeit der Transkriptionsfaktoren, mit DNA zu interagieren. Assays für die DNA-Bindung sind elektrophoretische Mobilität Shift-Assays (EMSA), die auf radioaktiv markierten Oligonukleotide 1 oder 2 Chemilumineszenzassays abhängen. Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) basierende Assays 3 sowie Assays, die 96-Well-4 wurden auch beschrieben. Jedoch ist die EMSA eine nicht-quantitativer Assay, der die Verwendung von radioaktiv markierten Oligonukleotiden erfordert. Als Kernproteine assoziieren mit den spezifischen Nukleotid-Promotor-Sequenzen, sind Bindungskomplexe auf Polyacrylamid-Gelen verzögert und die spezifische Transkriptionsfaktor kann mit einem Antikörper "Supershift" validiert werden. Wir haben eine quantitative DNA-Bindungsassay unter Verwendung eines Enzyme-Linked-Immunosorbent-Format (D-ELISA), die in der Lage, die Interaktion von RUNX2 mit DNA-Bindungssequenzen entsprechend definierten Promotorelemente zu messen, ist entwickelt in RUNX2 Zielgene. Verwendung eines Anti-Antikörpers enthält RUNX2 Spezifität des Assays und der Mangel an Radiomarkierung zeichnen diesen Assay vom herkömmlichen Gel-Shift-Assay-5. Nachweis von Bindungskomplexen ist mit der Verwendung eines sekundären Antikörpers, der mit Meerrettich-Peroxidase (HRP), die eine HRP-Substrat Tetramethylbenzidin (TMB) in ein gefärbtes Produkt spektrophotometrische Analyse umwandelt möglich. Der Test hier berichtet die Verwendung von mutierten DNA-Oligonukleotide als Kontrolle übernehmen und kann zum Nachweis von kompetitiven oder nicht-kompetitiven Inhibitoren der DNA-Bindung verwendet werden. Das Screening von neuen Anti-Tumor-Verbindungen ist ebenfalls mit diesem Assay möglich.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA-Bindungstests verwendet werden, um die Fähigkeit der Transkriptionsfaktoren, mit DNA in Wechselwirkung zu messen. Assays für die DNA-Bindung umfassen elektrophoretische Mobilitätsverschiebung (EMSA) 1 und Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) basierende Assays 3 sowie Assays, die 96-Well-4 wie Chemilumineszenzassays 2. Die EMSA ist nicht quantitative und verwendet radioaktiv markierte (32 P) Oligonukleotiden. Diese sind mit Kernproteinen inkubiert und Bindungs…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die technische Unterstützung und Instrumentierung der Universität von Maryland Greenebaum Cancer Center Translational Core Facility, insbesondere Drs. Rena Lapidus und Mariola Sadowska, werden dankbar anerkannt. Die für die Entwicklung dieses Tests zuständig Arbeit wurde zum Teil durch die NIH RO1CA108846, AHA Grant-in-Aid GRNT2130014, eine VA Merit Award an AP, und von der Universität von Maryland Zigarette Restitutionsfonds (CRF) an der Marlene Stewart & vorgesehen finanziert Greenebaum Cancer Center.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Poly dI/dC | GE Healthcare, Piscataway, NJ | US20539-5UN | 1 U ~50mg |
| RUNX2 antibody | MBL International Corp., Woburn, MA | D130-3 | 1 mg/ml |
| Fab-specific peroxidase conjugated antibody | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9917 | 7.1 mg/ml |
| TMB Substrate (tetramethyl benzidine) | EXALPHA Biologicals, Shirley, MA | X1189S | 100 ml |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 57995 | Plate-fixing |
| Sulfuric Acid | VWR, West Chester, PA | BDH-39922-1 | Stop solution |
| Multi-well plates | Greiner Bio-One, Basel, Switzerland | 655996 | Avidin-coated, black sides |
| HALT | Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL | 78440 | Protease and phosphatase inhibitors |
| Chemicals | Various manufacturers | Laboratory grade | |
| Table 1. Reagents | |||
| Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader | Amersham Biosciences | For use with stop reaction method | |
| Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader | Bio-Tek Instruments, Inc. | For use with continuous kinetic monitoring | |
| Table 2. Equipment |
References
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