כמותי Assay לחקר חלבון: אינטראקציות-DNA, רגולטורים גלו תעתיק של ביטוי גנים, ולזהות חומרים אנטי סרטניים רומן
Summary
פיתחנו assay כמותיים-DNA מחייבת, המבוסס על ELISA למדוד אינטראקציות עם גורם שעתוק ה-DNA. סגוליות גבוהה לחלבון Runx2 הושג עם oligonucleotide DNA לזיהוי קונסנסוס ונוגדנים חד שבטיים ספציפיים. איתור Colorimetric עם תגובת מצע נוגדנים בשילוב אנזים היה פיקוח בזמן אמת.
Abstract
מבחני ה-DNA מחייבת רבים כגון מבחני משמרת ניידות electrophoretic (EMSA), מבחני chemiluminescent, immunoprecipitation הכרומטין (שבב) המבוסס על מבחני, ומבחנים מבוססי multiwell משמשים למדידת פעילות גורם שעתוק. עם זאת, מבחני אלה הם nonquantitative, חסרי ייחוד, עשוי להיות כרוכים בשימוש בoligonucleotides רדיואקטיבי, ולא יכולים להיות ישים להקרנה של מעכבים של ה-DNA המחייבים. מצד השני, באמצעות assay כמותיים-DNA מחייבת צמוד אנזים immunosorbent (D-ELISA) assay, אנחנו מדגימים אינטראקציות חלבון גרעיניות עם ה-DNA באמצעות גורם שעתוק Runx2 שתלוי בקשר ספציפי עם רצפי ה-DNA מחייבת קונסנסוס נוכחי ביוטין oligonucleotides שכותרתו. הכנת תאים, מיצוי של חלבון גרעיני, ועיצוב של oligonucleotides גדילים הכפולה מתוארים. צלחות 96 היטב מצופה Avidin קבועות עם חיץ אלקליין וטופחו עם חלבונים גרעיניים במאגר נוקלאוטיד חסימה. Follבשל שטיפה נרחבת של הצלחות, נוגדן ראשוני ספציפי וincubations נוגדנים משני ואחריו התוספת של מצע חזרת peroxidase ופיתוח של תגובת colorimetric. מצב תגובת עצירה או ניטור רציף הקינטית שימש למדידת אינטראקציה חלבון עם DNA כמותית. אנחנו דנים בבקרות ספציפיות מתאימות, כוללים טיפול עם IgG אינו ספציפי או בלי חלבון או נוגדן ראשוני. יישומים של assay מתוארים כוללים השירות שלה בהקרנת סמים ותוצאות חיוביות ושליליות נציג הם דנו.
Introduction
יש מבחני ה-DNA מחייבת שירות במדידת היכולת של גורמי שעתוק כדי לקיים אינטראקציה עם ה-DNA. מבחני עבור ה-DNA מחייבים לכלול מבחני electrophoretic משמרת ניידות (EMSA) שתלויים בoligonucleotides radiolabeled 1 או מבחני chemiluminescence 2. מבחני מבוססים immuneprecipitation הכרומטין (שבב) 3, כמו גם מבחני העסקת פורמטי 96 היטב 4 גם תוארו. עם זאת, EMSA הוא assay שאינו כמותיים הדורש את השימוש של oligonucleotides רדיואקטיבי. כאשר חלבונים גרעיניים לקשר עם רצפי אמרגן נוקלאוטיד הספציפיים, מתחמי מחייבים הם מפגרים בג'לים polyacrylamide וגורמים שעתוק הספציפי יכול להיות מאומת עם "supershift" נוגדן. פיתחנו assay-DNA מחייבת כמותית באמצעות פורמט צמוד אנזים immunosorbent (D-ELISA), אשר מסוגל למדוד את האינטראקציה של Runx2 עם רצפי ה-DNA מחייבת המתאימים לאלמנטי אמרגן מוגדרים iגנים מטרת Runx2 n. שימוש בנוגדן אנטי Runx2 מספק סגוליות לassay וחוסר radiolabel להבחין assay זה מassay משמרת ג'ל המסורתי 5. איתור של מתחמים מחייבים אפשרי עם השימוש בנוגדנים משני מצמידים את חזרת peroxidase (HRP), אשר ממיר מצע HRP, tetramethyl benzidine (TMB) למוצר בצבע לניתוח spectrophotometric. Assay דיווח כאן ניתן לשלב את השימוש של oligonucleotides DNA מוטציה שולטת ויכול לשמש לזיהוי של מעכבים תחרותיים או לא תחרותיים של ה-DNA המחייב. ההקרנה של תרכובות אנטי סרטניים רומן אפשרי גם עם assay זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מבחני ה-DNA מחייב משמשים למדידת היכולת של גורמי שעתוק כדי לקיים אינטראקציה עם ה-DNA. מבחני עבור ה-DNA מחייבים כוללים משמרת electrophoretic ניידות (EMSA) 1 וimmuneprecipitation הכרומטין (שבב) מבוסס מבחני 3, כמו גם מבחני העסקת פורמטי 96 היטב 4 כגון מבחני chemiluminescent 2. EMSA הוא שא…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
סיוע טכני והמכשור של מתקן Greenebaum המרכז לחקר סרטן Translational Core אוניברסיטת מרילנד, במיוחד בני הזוג. רינה לפידוס וMariola Sadowska, הם הכירו בהכרת תודה. העבודה אחראית לפיתוח של assay זה מומנה בחלקו על ידי NIH RO1CA108846, AHA GRNT2130014 גרנט-in-Aid, פרס הצטיינות VA לסוכנות הידיעות AP, ועל ידי האוניברסיטה של כספי פיצויי סיגריות מרילנד (CRF) הניתן למרלן וסטיוארט מרכז לחקר סרטן Greenebaum.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Poly dI/dC | GE Healthcare, Piscataway, NJ | US20539-5UN | 1 U ~50mg |
| RUNX2 antibody | MBL International Corp., Woburn, MA | D130-3 | 1 mg/ml |
| Fab-specific peroxidase conjugated antibody | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9917 | 7.1 mg/ml |
| TMB Substrate (tetramethyl benzidine) | EXALPHA Biologicals, Shirley, MA | X1189S | 100 ml |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 57995 | Plate-fixing |
| Sulfuric Acid | VWR, West Chester, PA | BDH-39922-1 | Stop solution |
| Multi-well plates | Greiner Bio-One, Basel, Switzerland | 655996 | Avidin-coated, black sides |
| HALT | Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL | 78440 | Protease and phosphatase inhibitors |
| Chemicals | Various manufacturers | Laboratory grade | |
| Table 1. Reagents | |||
| Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader | Amersham Biosciences | For use with stop reaction method | |
| Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader | Bio-Tek Instruments, Inc. | For use with continuous kinetic monitoring | |
| Table 2. Equipment |
References
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay. Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).
- Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays. BMC Genomics. 10, 497 (2009).
- Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses. FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).
- D’Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway. J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).
- Underwood, K. F., D’Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity. J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).
- Held, P. Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations. Biotek Instruments Application Note. , (2007).
- Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Res. 29, E21 (2001).
- Pommier, Y. DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).
- Pennisi, E. Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA. Science. 337, 1159-1161 (2012).
