जीन एक्सप्रेशन का डीएनए बातचीत, डिस्कवर transcriptional नियामकों, और उपन्यास विरोधी ट्यूमर एजेंटों की पहचान: प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए एक मात्रात्मक परख
Summary
हम डीएनए के साथ प्रतिलेखन कारक बातचीत को मापने के लिए एक मात्रात्मक डीएनए बाध्यकारी, एलिसा आधारित परख विकसित की है. RUNX2 प्रोटीन के लिए उच्च विशिष्टता एक आम सहमति डीएनए मान्यता oligonucleotide और विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ हासिल की थी. एक एंजाइम युग्मित एंटीबॉडी सब्सट्रेट प्रतिक्रिया के साथ वर्णमिति पता लगाने के वास्तविक समय में नजर रखी थी.
Abstract
ऐसे electrophoretic गतिशीलता पारी assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (चिप) आधारित assays, और multiwell आधारित assays के रूप में कई डीएनए बाध्यकारी assays प्रतिलेखन कारक गतिविधि को मापने के लिए किया जाता है. हालांकि, इन assays, nonquantitative हैं विशिष्टता की कमी है, radiolabeled oligonucleotides के इस्तेमाल को शामिल कर सकते हैं, और बाध्यकारी डीएनए के inhibitors की स्क्रीनिंग के लिए अनुकूल नहीं हो सकता है. दूसरी ओर, एक मात्रात्मक डीएनए बाध्यकारी एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (डी एलिसा) परख का उपयोग कर, हम बायोटिन पर मौजूद आम सहमति डीएनए बाध्यकारी दृश्यों के साथ विशेष सहयोग पर निर्भर करती है कि RUNX2 प्रतिलेखन कारक का उपयोग डीएनए के साथ परमाणु बातचीत प्रोटीन का प्रदर्शन लेबल oligonucleotides. कोशिकाओं की तैयारी, परमाणु प्रोटीन, और डबल असहाय oligonucleotides के डिजाइन की निकासी वर्णित हैं. Avidin में लिपटे 96 अच्छी तरह प्लेटें क्षारीय बफर के साथ तय की और न्यूक्लियोटाइड अवरुद्ध बफर में परमाणु प्रोटीन के साथ incubated हैं. Follप्लेटों की व्यापक धोने, विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी और माध्यमिक एंटीबॉडी incubations कारण वर्णमिति प्रतिक्रिया की हॉर्सरैडिश peroxidase सब्सट्रेट और विकास के अलावा द्वारा पीछा कर रहे हैं. बंद करो प्रतिक्रिया मोड या निरंतर गतिज निगरानी मात्रात्मक डीएनए के साथ प्रोटीन बातचीत को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया. हम गैर विशिष्ट आईजीजी साथ या प्रोटीन या प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना उपचार सहित उपयुक्त विशिष्टता नियंत्रण, पर चर्चा की. परख के आवेदन इसकी दवा स्क्रीनिंग में उपयोगिता और प्रतिनिधि सकारात्मक और नकारात्मक परिणामों पर चर्चा कर रहे हैं सहित वर्णित हैं.
Introduction
डीएनए बाध्यकारी assays के डीएनए के साथ बातचीत करने के लिए प्रतिलेखन कारक की क्षमता को मापने में उपयोगिता है. बंधन डीएनए के लिए assays radiolabeled oligonucleotides 1 या chemiluminescence assays 2 पर निर्भर है कि electrophoretic गतिशीलता पारी assays (EMSA) शामिल हैं. 96 अच्छी तरह स्वरूपों 4 रोजगार chromatin immuneprecipitation (चिप) आधारित assays 3 के साथ ही assays भी वर्णन किया गया है. हालांकि, EMSA radiolabeled oligonucleotides के उपयोग की आवश्यकता है कि एक गैर मात्रात्मक परख है. परमाणु प्रोटीन विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड प्रमोटर दृश्यों के साथ संबद्ध करते हैं, बंधन परिसरों polyacrylamide जैल पर मंद कर रहे हैं और विशिष्ट प्रतिलेखन कारक एक एंटीबॉडी "supershift" के साथ मान्य किया जा सकता है. हम परिभाषित प्रमोटर तत्वों को इसी डीएनए बाध्यकारी दृश्यों के साथ RUNX2 की बातचीत के उपाय करने में सक्षम है जो एक एंजाइम से जुड़ी immunosorbent प्रारूप (डी एलिसा), का उपयोग कर एक मात्रात्मक डीएनए बाध्यकारी परख विकसित किया है मैंn RUNX2 लक्ष्य जीन. एक विरोधी RUNX2 एंटीबॉडी का प्रयोग परख करने के लिए विशिष्टता प्रदान करता है और radiolabel की कमी परंपरागत जेल शिफ्ट परख 5 से इस परख भेद. बंधन परिसरों की जांच spectrophotometric विश्लेषण के लिए एक रंग उत्पाद के लिए एक एचआरपी सब्सट्रेट, tetramethyl बैन्जीडाइन (TMB) धर्मान्तरित जो हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी), मिलकर माध्यमिक एंटीबॉडी के उपयोग के साथ संभव है. यहां बताया परख नियंत्रण के रूप में उत्परिवर्तित डीएनए oligonucleotides के इस्तेमाल को शामिल कर सकते हैं और बाध्यकारी डीएनए की प्रतियोगी या गैर प्रतिस्पर्धी inhibitors का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उपन्यास विरोधी ट्यूमर यौगिकों की स्क्रीनिंग इस परख के साथ भी संभव है.
Protocol
Representative Results
Discussion
डीएनए बाध्यकारी assays के डीएनए के साथ बातचीत करने के लिए प्रतिलेखन कारक की क्षमता को मापने के लिए किया जाता है. बंधन डीएनए के लिए assays electrophoretic गतिशीलता पारी (EMSA) 1 और chromatin immuneprecipitation (चिप) आधारित assays 3 के साथ ही 96 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
तकनीकी सहायता और मैरीलैंड विश्वविद्यालय के Greenebaum कैंसर केंद्र Translational कोर सुविधा, विशेष रूप से डीआरएस का इंस्ट्रूमेंटेशन. Rena Lapidus और Mariola Sadowska, कृतज्ञता स्वीकार कर रहे हैं. इस परख के विकास के लिए जिम्मेदार काम एनआईएच RO1CA108846, अहा अनुदान सहायता GRNT2130014, एपी के एक वीए मेरिट पुरस्कार, द्वारा और मैरीलैंड सिगरेट क्षतिपूर्ति फंड विश्वविद्यालय (सीआरएफ) मार्लिन और स्टीवर्ट के लिए प्रदान हिस्से में वित्त पोषित किया गया था Greenebaum कैंसर केंद्र.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Poly dI/dC | GE Healthcare, Piscataway, NJ | US20539-5UN | 1 U ~50mg |
| RUNX2 antibody | MBL International Corp., Woburn, MA | D130-3 | 1 mg/ml |
| Fab-specific peroxidase conjugated antibody | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9917 | 7.1 mg/ml |
| TMB Substrate (tetramethyl benzidine) | EXALPHA Biologicals, Shirley, MA | X1189S | 100 ml |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 57995 | Plate-fixing |
| Sulfuric Acid | VWR, West Chester, PA | BDH-39922-1 | Stop solution |
| Multi-well plates | Greiner Bio-One, Basel, Switzerland | 655996 | Avidin-coated, black sides |
| HALT | Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL | 78440 | Protease and phosphatase inhibitors |
| Chemicals | Various manufacturers | Laboratory grade | |
| Table 1. Reagents | |||
| Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader | Amersham Biosciences | For use with stop reaction method | |
| Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader | Bio-Tek Instruments, Inc. | For use with continuous kinetic monitoring | |
| Table 2. Equipment |
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