Un quantitativo test per studiare proteine: DNA interazioni, Discover trascrizionali regolatori dell'espressione genica, e identificare nuovi agenti anti-tumorali
Summary
Abbiamo sviluppato un DNA-binding, dosaggio quantitativo basato su ELISA per misurare le interazioni tra fattori di trascrizione con il DNA. Alta specificità per la proteina RUNX2 è stato raggiunto con un consenso DNA riconoscimento oligonucleotide e anticorpo monoclonale specifico. Rilevamento colorimetrico con una reazione substrato anticorpo enzimatico accoppiato stata monitorata in tempo reale.
Abstract
Molti legano il DNA test come test di spostamento mobilità elettroforetica (EMSA), saggi chemiluminescenti, immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) a base di saggi e saggi pozzetti-based sono utilizzati per misurare attività del fattore di trascrizione. Tuttavia, questi saggi sono nonquantitative, mancano di specificità, possono comportare l'uso di oligonucleotidi radiomarcati, e non possono essere adattabile per lo screening di inibitori di legame al DNA. D'altra parte, utilizzando un saggio quantitativo di legame al DNA immunoenzimatico (ELISA-D) Test, dimostriamo interazioni proteina nucleare con DNA utilizzando il fattore di trascrizione RUNX2 che dipendono specifica associazione con consenso DNA-binding sequenze presenti sulla biotina- oligonucleotidi etichettati. Preparazione delle cellule, estrazione di proteine nucleari, e la progettazione di oligonucleotidi a doppio filamento sono descritti. Piastre a 96 pozzetti rivestite di avidina sono fissati con tampone alcalino e incubate con proteine nucleari a nucleotide tampone di bloccaggio. Follgrazie lavaggio estensivo delle piastre, l'anticorpo primario specifico e incubazioni anticorpi secondari sono seguiti dall'aggiunta di substrato perossidasi di rafano e lo sviluppo della reazione colorimetrica. Modalità di reazione di arresto o il monitoraggio continuo cinetica sono stati utilizzati per misurare quantitativamente l'interazione delle proteine con il DNA. Discutiamo adeguati controlli specificità, compreso il trattamento con i non-IgG specifiche o senza proteine o anticorpo primario. Applicazioni del saggio sono descritte compresa la sua utilità in screening di farmaci e risultati positivi e negativi rappresentativi sono discussi.
Introduction
DNA-binding saggi hanno utilità nel misurare la capacità dei fattori di trascrizione per interagire con il DNA. I saggi di legame al DNA includono elettroforetici saggi mobility shift (EMSA) che dipendono da oligonucleotidi radioattivi 1 o saggi chemiluminescenza 2. Saggi cromatina immuneprecipitation (chip) basate 3 e saggi che impiegano formati da 96 pozzetti 4 sono state descritte. Tuttavia, l'EMSA è un'analisi non quantitativa che richiede l'uso di oligonucleotidi radiomarcati. Quando le proteine nucleari associano con le specifiche sequenze promotrici nucleotide, complessi vincolanti sono ritardati su gel di poliacrilammide e il fattore di trascrizione specifico possono essere convalidati con un anticorpo "supershift". Abbiamo sviluppato un saggio di legame al DNA quantitativa utilizzando un formato di immunoassorbimento enzimatico (ELISA-D), che è in grado di misurare l'interazione di RUNX2 con DNA-binding sequenze corrispondenti ad elementi promotori definiti igeni bersaglio n Runx2. Uso di un anticorpo anti-RUNX2 fornisce specificità per il dosaggio e la mancanza di radiotracciante distinguere questo saggio dal tradizionale saggio di spostamento gel 5. Rilevamento di complessi di legame è possibile con l'uso di un anticorpo secondario accoppiato a perossidasi di rafano (HRP), che converte un substrato HRP, tetrametil benzidina (TMB) in un prodotto colorato per l'analisi spettrofotometrica. Il saggio qui riportato può incorporare l'uso di oligonucleotidi di DNA mutati i controlli e può essere utilizzato per il rilevamento di inibitori competitivi e non competitivi di DNA vincolanti. Lo screening di nuovi composti antitumorali è possibile anche con questo test.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA-binding saggi vengono utilizzati per misurare la capacità dei fattori di trascrizione per interagire con il DNA. I saggi di legame per DNA includono spostamento elettroforetico mobilità (EMSA) 1 e immuneprecipitation cromatina (ChIP) saggi basati 3 nonché saggi occupata formati da 96 pozzetti 4 come saggi chemiluminescenti 2. L'EMSA è non-quantitativa e utilizza radioattivo (32 P) oligonucleotidi. Questi sono incubati con proteine nucleari e comple…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L'assistenza tecnica e la strumentazione della University of Maryland Greenebaum Cancer Center traslazionale Nucleo Fondo, in particolare Drs. Rena Lapidus e Mariola Sadowska, sono riconosciuti con gratitudine. Il lavoro di responsabile per lo sviluppo di questo test è stato finanziato in parte dal NIH RO1CA108846, AHA Grant-in-Aid GRNT2130014, un VA Merit Award per AP, e l'Università del Maryland sigaretta restituzione Funds (CRF) fornita al Marlene & Stewart Greenebaum Cancer Center.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Poly dI/dC | GE Healthcare, Piscataway, NJ | US20539-5UN | 1 U ~50mg |
| RUNX2 antibody | MBL International Corp., Woburn, MA | D130-3 | 1 mg/ml |
| Fab-specific peroxidase conjugated antibody | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9917 | 7.1 mg/ml |
| TMB Substrate (tetramethyl benzidine) | EXALPHA Biologicals, Shirley, MA | X1189S | 100 ml |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 57995 | Plate-fixing |
| Sulfuric Acid | VWR, West Chester, PA | BDH-39922-1 | Stop solution |
| Multi-well plates | Greiner Bio-One, Basel, Switzerland | 655996 | Avidin-coated, black sides |
| HALT | Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL | 78440 | Protease and phosphatase inhibitors |
| Chemicals | Various manufacturers | Laboratory grade | |
| Table 1. Reagents | |||
| Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader | Amersham Biosciences | For use with stop reaction method | |
| Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader | Bio-Tek Instruments, Inc. | For use with continuous kinetic monitoring | |
| Table 2. Equipment |
References
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay. Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).
- Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays. BMC Genomics. 10, 497 (2009).
- Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses. FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).
- D’Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway. J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).
- Underwood, K. F., D’Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity. J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).
- Held, P. Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations. Biotek Instruments Application Note. , (2007).
- Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Res. 29, E21 (2001).
- Pommier, Y. DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).
- Pennisi, E. Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA. Science. 337, 1159-1161 (2012).
