유전자 발현의 DNA 상호 작용, 디스 전사 레귤레이터, 그리고 소설 안티 종양 에이전트를 식별 : 단백질을 연구하는 정량 분석
Summary
우리는 DNA 전사 인자와의 상호 작용을 측정하는 정량적 DNA-결합, ELISA 기반 분석법을 개발 하였다. RUNX2 단백질에 대한 높은 특이성은 합의 DNA 인식 올리고 뉴클레오티드 및 특정 단일 클론 항체를 달성했다. 효소 결합 항체 반응 기질과 발색 검출은 실시간으로 모니터링 하였다.
Abstract
이러한 전기 영동 이동성 이동 분석 (EMSA), 화학 발광 분석법, 크로 마틴 면역 침전 (칩) 기반의 분석 및 멀티 웰 기반의 분석과 같은 많은 DNA-결합 분석은 전사 인자의 활성을 측정하는 데 사용됩니다. 그러나 이러한 분석은, nonquantitative 있습니다 특이성이 부족, 방사성 동위 원소 표지 된 올리고 뉴클레오티드의 사용을 포함 할 수 있으며, 바인딩 DNA의 억제제의 검사에 대한 적응력이되지 않을 수 있습니다. 한편, 정량적 DNA 결합 효소 결합 면역 분석법 (D-ELISA) 분석을 이용하여, 우리는 바이오틴에 존재 컨센서스 DNA 결합 서열과 특정 관계에 의존 RUNX2 전사 인자를 사용하여 DNA와 핵 단백질 상호 작용을 보여 표지 올리고 뉴클레오티드. 세포의 제조, 핵 단백질, 및 이중 가닥 올리고 뉴클레오티드의 디자인의 추출 기술되어있다. 아비딘 코팅 된 96 – 웰 플레이트는 알칼리성 버퍼 고정 염기 차단 버퍼의 핵 단백질로 배양된다. FOLL플레이트의 광범위한 세정 특정 일차 항체 및 이차 항체 배양을 인해서 비색 반응 냉이 퍼 옥시 다제 기질과 발전 첨가하여된다. 정지 반응 키네틱 모드 또는 연속 모니터링 정량적 DNA와 단백질의 상호 작용을 측정하기 위해 사용되었다. 우리는 비 특이 IgG 또는 단백질 또는 일차 항체없이 치료 등의 적절한 특이성 컨트롤을 설명합니다. 분석의 응용 프로그램은 그 약물 검사에서 유틸리티 대표 긍정 및 부정적인 결과를 설명하는 등의 설명되어 있습니다.
Introduction
DNA-결합 분석은 DNA와 상호 작용하는 전사 인자의 능력을 측정하는데 유용성을 갖는다. 바인딩 DNA에 대한 분석은 방사성 동위 원소 표지 된 올리고 뉴클레오타이드 1 또는 화학 발광 분석법에 달려있는 전기 이동성 이동 분석 (EMSA) 등이 있습니다. 96 – 웰 형식 4를 사용 염색질 immuneprecipitation (칩)을 기준으로 분석 3뿐만 아니라 분석도 기재되어있다. 그러나 EMSA는 방사성 표지 된 올리고 뉴클레오티드의 사용을 필요로 비 정량 분석법이다. 핵 단백질이 특정 염기 프로모터 서열에 연결할 때, 바인딩 단지는 폴리 아크릴 아마이드 젤에 지체하고 특정 전사 인자가 항체 "supershift"로 유효성을 검사 할 수 있습니다. 우리는 정의 된 프로모터 요소에 대응하는 DNA 결합 서열과 RUNX2의 상호 작용을 측정 할 수있는 효소 – 결합 면역 포맷 (D-ELISA)을 이용하여 정량적 인 DNA-결합 분석을 개발 IN 개의 RUNX2 표적 유전자. 반대로 RUNX2 항체의 사용은 분석 특이성을 제공하고, 방사선 표지의 부족은 전통적인 겔 쉬프트 분석이 분석에서 5 구별. 바인딩 착물의 검출은 분광 광도 분석을위한 착색 된 제품에 HRP 기질, 테트라 메틸 벤지딘 (TMB)을 변환 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)에 결합 된 이차 항체를 이용하여 가능하다. 여기에보고 된 분석은 컨트롤과 같은 변이 된 DNA 올리고 뉴클레오티드의 사용을 포함 할 수 있으며 DNA 결합의 경쟁적 또는 비 경쟁적 억제제의 검출을 위해 사용될 수있다. 새로운 항 종양 화합물의 심사는이 분석도 가능하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA-결합 분석은 DNA와 상호 작용하는 전사 인자의 능력을 측정하기 위해 사용된다. 바인딩 DNA에 대한 분석은 전기 이동성의 변화 (EMSA) 1 염색질 immuneprecipitation (칩)을 기준으로 분석 3뿐만 아니라 96 – 웰 형식에게 이러한 화학 발광 분석법 2와 4를 사용 분석을 포함한다. EMSA가 아닌 정량적이고 방사성 동위 원소 (32 P) 올리고 뉴클레오티드를 사용합니다. 이러한 핵 단…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
기술 지원 및 메릴랜드 대학 그린 바움 암 센터의 번역 상 핵심 시설, 특히 박사 부부의 계측. 레나 래피 더스와 Mariola Sadowska은 기꺼이 인정합니다. 이 분석의 개발을 담당 작품은 NIH RO1CA108846, AHA 그랜트 -에 – 보조 GRNT2130014, AP에 VA 공로상에 의해 메릴랜드 담배 배상 기금의 대학 (CRF) 마린 & 스튜어트 제공에 의해 부분적으로 투자되었다 그린 바움 암 센터.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Poly dI/dC | GE Healthcare, Piscataway, NJ | US20539-5UN | 1 U ~50mg |
| RUNX2 antibody | MBL International Corp., Woburn, MA | D130-3 | 1 mg/ml |
| Fab-specific peroxidase conjugated antibody | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9917 | 7.1 mg/ml |
| TMB Substrate (tetramethyl benzidine) | EXALPHA Biologicals, Shirley, MA | X1189S | 100 ml |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 57995 | Plate-fixing |
| Sulfuric Acid | VWR, West Chester, PA | BDH-39922-1 | Stop solution |
| Multi-well plates | Greiner Bio-One, Basel, Switzerland | 655996 | Avidin-coated, black sides |
| HALT | Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL | 78440 | Protease and phosphatase inhibitors |
| Chemicals | Various manufacturers | Laboratory grade | |
| Table 1. Reagents | |||
| Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader | Amersham Biosciences | For use with stop reaction method | |
| Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader | Bio-Tek Instruments, Inc. | For use with continuous kinetic monitoring | |
| Table 2. Equipment |
References
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