En kvantitativ analyse for å studere Protein: DNA interaksjoner, Discover Transcriptional regulatorer Gene Expression, og identifisere nye anti-tumor Agenter
Summary
Vi har utviklet en kvantitativ DNA-bindende ELISA-basert assay for å måle transkripsjonsfaktor interaksjon med DNA. Høy spesifisitet for RUNX2 protein ble oppnådd med en konsensus-DNA-gjenkjenning oligonukleotid og spesifikt monoklonalt antistoff. Kolorimetrisk deteksjon med en enzym-koblet antistoff substrat reaksjonen ble overvåket i sann tid.
Abstract
Mange DNA-binding assays slik som elektroforetisk mobilitet shift assay (EMSA), kjemiluminescerende assay, kromatin immunoutfelling (chip)-baserte analyser, og multibrønn-baserte assays blir brukt til å måle transkripsjonsfaktor-aktivitet. Men disse analysene er nonquantitative, mangler spesifisitet, kan innebære bruk av radioaktivt merkede oligonukleotider, og er kanskje ikke kunne tilpasses for screening av inhibitorer av DNA-binding. På den annen side, ved hjelp av en kvantitativ DNA-bindende enzyme-linked immunosorbent assay (D-ELISA)-analyse, demonstrerer vi atom protein interaksjoner med DNA ved hjelp av RUNX2 transkripsjonsfaktor som er avhengig av spesifikk assosiasjon med konsensus-DNA-bindende sekvenser som er tilstede på biotin- merket oligonukleotider. Fremstilling av celler, utvinning av kjerneprotein, og utformingen av dobbelt-trådet oligonukleotider er beskrevet. Avidin-belagte 96-brønners plater er festet med alkalisk buffer og inkubert med nukleære proteiner i nukleotid-blokkerende buffer. Føllpå grunn av omfattende vasking av platene, spesifikk primære antistoff og sekundære antistoff inkubasjoner blir etterfulgt av tilsetning av pepperrot-peroksydase-substrat og utvikling av kolorimetrisk reaksjon. Stopp reaksjonen modus eller kontinuerlig kinetisk overvåkning ble brukt til kvantitativt å måle protein interaksjon med DNA. Vi diskuterer passende spesifisitet kontroller, inkludert behandling med ikke-spesifikk IgG-eller uten protein eller primære antistoff. Anvendelser av analysen er beskrevet blant annet sin nytte i medikamentscreening og representative positive og negative resultater er omtalt.
Introduction
DNA-binding assays kan anvendes for å måle evnen av transkripsjonsfaktorene til å interagere med DNA. Analyser for DNA bindende omfatter elektromobilitet skift analyser (EMSA) som er avhengige av radiomerket oligonukleotider en eller chemiluminescence analyser to. Kromatin immuneprecipitation (chip) baserte analyser 3 samt analyser sysselsetter 96-brønners formater 4 har også blitt beskrevet. Imidlertid er EMSA en ikke-kvantitativ analyse som krever bruk av radioaktivt merkede oligonukleotider. Når kjerneproteiner forbinder med den spesielle nukleotid-promotorsekvensene, bindende komplekser er retardert på polyakrylamidgeler og den spesifikke transkripsjonsfaktor kan bekreftes med et antistoff "supershift". Vi har utviklet en kvantitativ DNA-bindingsanalyse ved bruk av en enzym-bundet immunosorbent-format (D-ELISA), som er i stand til å måle interaksjonen av RUNX2 med DNA-bindende sekvenser som tilsvarer definerte promotorelementer in RUNX2 målgener. Anvendelse av et anti-antistoff RUNX2 gir spesifisitet til analysen og mangel på radiomerket substans skille denne analysen fra den tradisjonelle gel shift assay 5. Påvisning av bindingskomplekser er mulig med bruk av et sekundært antistoff koplet til pepperrotperoksidase (HRP), som omdanner et HRP-substrat, tetrametylbenzidin (TMB) til et farget produkt for spektrofotometrisk analyse. Analysen rapportert her, kan omfatte bruk av muterte DNA-oligonukleotider som kontroller, og kan brukes for deteksjon av konkurrerende eller ikke-konkurrerende hemmere av DNA-binding. Den screening av nye anti-tumorforbindelser er også mulig med denne analysen.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA-bindingsanalysene er brukt til å måle evnen av transkripsjonsfaktorene til å interagere med DNA. Analyser for DNA bindende omfatter elektromobilitet shift (EMSA) 1 og kromatin immuneprecipitation (chip) baserte analyser 3 samt analyser sysselsetter 96-brønners formater fire som kjemiluminescente analyser to. EMSA er ikke-kvantitative og bruker radiomerket (32 P) oligonukleotider. Disse inkuberes med kjerneproteiner og binde komplekser separeres på agarose-e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den teknisk assistanse og instrumentering ved University of Maryland Greenebaum Cancer Center Translasjonell Kjerne Facility, spesielt legene. Rena Lapidus og Mariola Sadowska, er takknemlig erkjent. Arbeidet er ansvarlig for utviklingen av denne analysen ble finansiert delvis av NIH RO1CA108846, AHA Grant-i-Aid GRNT2130014, en VA Merit Award til AP, og ved University of Maryland Sigarett Restitusjons Funds (CRF) gitt til Marlene & Stewart Greenebaum Cancer Center.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Poly dI/dC | GE Healthcare, Piscataway, NJ | US20539-5UN | 1 U ~50mg |
| RUNX2 antibody | MBL International Corp., Woburn, MA | D130-3 | 1 mg/ml |
| Fab-specific peroxidase conjugated antibody | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9917 | 7.1 mg/ml |
| TMB Substrate (tetramethyl benzidine) | EXALPHA Biologicals, Shirley, MA | X1189S | 100 ml |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 57995 | Plate-fixing |
| Sulfuric Acid | VWR, West Chester, PA | BDH-39922-1 | Stop solution |
| Multi-well plates | Greiner Bio-One, Basel, Switzerland | 655996 | Avidin-coated, black sides |
| HALT | Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL | 78440 | Protease and phosphatase inhibitors |
| Chemicals | Various manufacturers | Laboratory grade | |
| Table 1. Reagents | |||
| Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader | Amersham Biosciences | For use with stop reaction method | |
| Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader | Bio-Tek Instruments, Inc. | For use with continuous kinetic monitoring | |
| Table 2. Equipment |
References
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay. Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).
- Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays. BMC Genomics. 10, 497 (2009).
- Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses. FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).
- D’Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway. J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).
- Underwood, K. F., D’Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity. J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).
- Held, P. Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations. Biotek Instruments Application Note. , (2007).
- Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Res. 29, E21 (2001).
- Pommier, Y. DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).
- Pennisi, E. Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA. Science. 337, 1159-1161 (2012).
