Uma análise quantitativa para o Estudo de Proteína: DNA interações, Discover Transcricionais Reguladores de Expressão Gênica e identificar novos agentes anti-tumorais
Summary
Foi desenvolvido um ensaio quantitativo de ligação de ADN à base de ELISA para medir as interacções com o factor de transcrição do ADN. Alta especificidade para a proteína RUNX2 foi conseguida com um oligonucleótido de ADN de reconhecimento de consenso e de anticorpo monoclonal específico. Detecção Colorimétrico com uma reacção do substrato, o anticorpo acoplado a enzima foi monitorizada em tempo real.
Abstract
Muitos ensaios de ligação de ADN, tais como ensaios de desvio de mobilidade electroforética (EMSA), ensaios quimioluminescentes, imunoprecipitação da cromatina (ChIP) à base de ensaios e ensaios baseados em múltiplos poços são usadas para medir a actividade do factor de transcrição. No entanto, estes ensaios são não quantitativa, carecem de especificidade, pode envolver o uso de oligonucleotídeos marcados radioactivamente, e pode não ser adaptável para a triagem de inibidores de ligação de ADN. Por outro lado, utilizando uma enzima ligada ao ensaio quantitativo de ligação de ADN imunossorvente (ELISA-D) de ensaio, que demonstram as interacções de proteínas nucleares com ADN, usando o factor de transcrição RUNX2 que dependem associação específica com as sequências de consenso de ligação de ADN presentes em biotina- oligonucleótidos marcados. Preparação de células, a extracção de proteínas nucleares, e concepção de oligonucleótidos de cadeia dupla são descritos. Placas de 96 poços revestidas com avidina foram fixados com tampão alcalino e incubadas com as proteínas nucleares, em tampão de bloqueio de nucleótidos. Folldevido a uma lavagem exaustiva das placas, o anticorpo primário específico e as incubações do anticorpo secundário é seguida pela adição de substrato de peroxidase de rábano e o desenvolvimento da reacção colorimétrica. Modo de reação Parar ou monitoramento contínuo cinética foram usados para medir quantitativamente a interação de proteínas com o DNA. Discute-se controlos adequados de especificidade, incluindo o tratamento com a IgG não específica ou sem proteína ou o anticorpo primário. Aplicações do ensaio encontram-se descritos, incluindo a sua utilidade na triagem de drogas e de resultados positivos e negativos representativos são discutidos.
Introduction
Os ensaios de ligação a DNA têm utilidade na medição da capacidade dos factores de transcrição que interagem com o ADN. Ensaios para DNA de ligação incluem ensaios de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) que dependem de oligonucleotídeos radiolabeled 1 ou 2 ensaios de quimiluminescência. Ensaios de cromatina immuneprecipitation (ChIP) com base 3, bem como ensaios que utilizem formatos de 96 poços 4 foram também descritas. No entanto, o EMSA é um ensaio quantitativo que não requer o uso de oligonucleotídeos marcados radioactivamente. Quando as proteínas nucleares associar com as sequências de nucleótidos de promotores específicos, complexos de ligação são retardados em géis de poliacrilamida e o factor de transcrição específico pode ser validado com um anticorpo "supershift". Nós desenvolvemos um ensaio quantitativo de ligação de ADN utilizando um formato de imunossorvente ligado a enzima (ELISA-D), o qual é capaz de medir a interacção de RUNX2 com sequências de ligação de ADN correspondentes aos elementos promotores definidos igenes alvo n Runx2. Utilização de um anticorpo anti-RUNX2 fornece especificidade para o ensaio e a ausência de marcação radioactiva distinguir este ensaio a partir do teste de deslocamento em gel tradicional 5. Detecção de complexos de ligação é possível com a utilização de um anticorpo secundário acoplado a peroxidase de rábano (HRP), que converte um substrato de HRP, tetrametilbenzidina (TMB) a um produto de cor para a análise espectrofotométrica. O ensaio aqui relatado pode incorporar a utilização de oligonucleótidos de ADN mutados como controlo e pode ser utilizada para detecção de inibidores competitivos ou não-competitivos da ligação de DNA. O rastreio de compostos anti-tumorais novos também é possível com este ensaio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os ensaios de ligação de ADN são usadas para medir a capacidade de factores de transcrição que interagem com o ADN. Os ensaios para a ligação de ADN incluem deslocamento da mobilidade electroforética (EMSA) e 1 immuneprecipitation cromatina (ChIP) Ensaios baseados em 3, bem como ensaios que utilizem formatos de 96 cavidades 4 tais como ensaios quimioluminescentes 2. A EMSA não é quantitativa e usa radioativo (32 P) oligonucleotídeos. Estas são incubadas …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A assistência técnica e instrumentação do Mecanismo de Universidade de Maryland Greenebaum Cancer Center Translational Core, especialmente os drs. Rena Lapidus e Mariola Sadowska, é altamente apreciada. O trabalho responsável pelo desenvolvimento deste ensaio foi financiado em parte pelo NIH RO1CA108846, AHA Grant-in-Aid GRNT2130014, um VA Prémio de Mérito a AP, e pela Universidade de Maryland cigarro fundos de reembolso (CRF), desde a Marlene & Stewart Centro de Câncer Greenebaum.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Poly dI/dC | GE Healthcare, Piscataway, NJ | US20539-5UN | 1 U ~50mg |
| RUNX2 antibody | MBL International Corp., Woburn, MA | D130-3 | 1 mg/ml |
| Fab-specific peroxidase conjugated antibody | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9917 | 7.1 mg/ml |
| TMB Substrate (tetramethyl benzidine) | EXALPHA Biologicals, Shirley, MA | X1189S | 100 ml |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 57995 | Plate-fixing |
| Sulfuric Acid | VWR, West Chester, PA | BDH-39922-1 | Stop solution |
| Multi-well plates | Greiner Bio-One, Basel, Switzerland | 655996 | Avidin-coated, black sides |
| HALT | Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL | 78440 | Protease and phosphatase inhibitors |
| Chemicals | Various manufacturers | Laboratory grade | |
| Table 1. Reagents | |||
| Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader | Amersham Biosciences | For use with stop reaction method | |
| Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader | Bio-Tek Instruments, Inc. | For use with continuous kinetic monitoring | |
| Table 2. Equipment |
References
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