Количественный Анализ по изучению белок: ДНК взаимодействий, Discover транскрипционных регуляторов экспрессии генов, и идентифицировать новые противоопухолевых средств
Summary
Мы разработали количественный ДНК-связывающий, ИФА на основе анализа для измерения фактора транскрипции взаимодействия с ДНК. Высокая специфичность для белка Runx2 была достигнута с консенсусной олигонуклеотида ДНК-распознавания и специфического моноклонального антитела. Колориметрические обнаружения с реакции с субстратом антитела с ферментом в сочетании контролировали в реальном времени.
Abstract
Многие ДНК-связывающие анализы, такие как электрофоретическая сдвига мобильность анализов (EMSA), хемилюминесцентных анализов, иммунопреципитации хроматина (чип) основе анализов и многолуночных основе анализов используются для измерения активность фактора транскрипции. Тем не менее, эти анализы неколичественные, отсутствие специфичности, может включать в себя использование меченных олигонуклеотидов, и не могут быть адаптированы для скрининга ингибиторов связывания ДНК. С другой стороны, с помощью количественного ДНК-связывающий иммуноферментного анализа (D-ELISA) анализа, мы демонстрируем ядерных белковых взаимодействий с ДНК, используя Runx2 транскрипционный фактор, что зависит от конкретной ассоциации с консенсус-ДНК-связывающих последовательностей, присутствующих на биотин- меченных олигонуклеотидов. Подготовка клеток, добыча ядерного белка, и дизайн двухцепочечных олигонуклеотидов описаны. Покрытые авидином 96-луночные планшеты с фиксированной щелочного буфера и инкубируют с ядерными белками в нуклеотидной блокирующем буфере. Фоллявследствие интенсивного промывания пластин, конкретной первичного антитела и вторичного антитела инкубации следуют добавлением субстрата пероксидазы хрена и развития колориметрической реакции. Режим реакция Стоп или непрерывный кинетическая мониторинга были использованы для количественного измерения взаимодействия белка с ДНК. Мы обсуждаем соответствующие элементы управления специфичности, в том числе лечения неспецифического IgG или без белка или первичного антитела. Применение анализа описаны в том числе его полезности в скрининге лекарственных и представительные положительные и отрицательные результаты обсуждаются.
Introduction
ДНК-связывающий анализы могут быть использованы при измерения способности факторов транскрипции, чтобы взаимодействовать с ДНК. Анализы на ДНК связывающие включают анализы электрофоретических сдвига подвижности (EMSA), которые зависят от меченных олигонуклеотидов 1 или хемилюминесценции анализов 2. Хроматина immuneprecipitation (чип) на основе анализов 3, а также анализы, использующие форматы 96-луночных 4 также были описаны. Тем не менее, EMSA не является количественный анализ, что требует использования радиоактивно меченных олигонуклеотидов. Когда ядерные белки ассоциируют с конкретными последовательностей нуклеотидов промоутер, связывающие комплексы отсталых на полиакриламидном геле и специфическим фактором транскрипции может быть подтверждено с антителом "supershift". Мы разработали количественный ДНК-анализа связывания с использованием твердофазного иммуноферментного формат (D-ELISA), который способен измерять взаимодействие RUNX2 с ДНК-связывающих последовательностей, соответствующих определенных промоторных элементов ян Runx2 генов-мишеней. Использование анти-антителом Runx2 обеспечивает специфичность анализа и отсутствие радиоактивной метки отличить этот анализ от традиционного анализа гель сдвига 5. Обнаружение связывания комплексов можно с использованием вторичного антитела, соединенного с пероксидазой хрена (HRP), который преобразует в HRP субстрат, тетраметилбензидин (ТМВ) в окрашенный продукт для спектрофотометрического анализа. Анализ сообщалось здесь, могут включать использование мутантных ДНК-олигонуклеотидов в качестве контроля и может быть использован для обнаружения конкурентных или неконкурентные ингибиторы ДНК-связывающий. Скрининг новых соединений противоопухолевых также возможно с этим анализом.
Protocol
Representative Results
Discussion
ДНК-связывающий анализы используются для измерения способности факторов транскрипции, чтобы взаимодействовать с ДНК. Анализы на ДНК связывающие включают электрофоретическую сдвиг мобильности (EMSA) 1 и хроматина immuneprecipitation (чип) анализы, основанные 3, а также анализов с испол…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Техническая помощь и приборы из Университета штата Мэриленд Greenebaum онкологический центр Поступательное основной комплекс, особенно д-ра. Рена Лапидус и Мариола Садовска, которые с благодарностью. Работа отвечает за развитие этого анализа была частично финансируется NIH RO1CA108846, AHA Грант-в-помощь GRNT2130014, заслуга премии В. А. П., и в Университете штата Мэриленд сигарет реституции фондов (ХПН), предоставляемой Марлен & Stewart Greenebaum онкологический центр.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Poly dI/dC | GE Healthcare, Piscataway, NJ | US20539-5UN | 1 U ~50mg |
| RUNX2 antibody | MBL International Corp., Woburn, MA | D130-3 | 1 mg/ml |
| Fab-specific peroxidase conjugated antibody | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9917 | 7.1 mg/ml |
| TMB Substrate (tetramethyl benzidine) | EXALPHA Biologicals, Shirley, MA | X1189S | 100 ml |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 57995 | Plate-fixing |
| Sulfuric Acid | VWR, West Chester, PA | BDH-39922-1 | Stop solution |
| Multi-well plates | Greiner Bio-One, Basel, Switzerland | 655996 | Avidin-coated, black sides |
| HALT | Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL | 78440 | Protease and phosphatase inhibitors |
| Chemicals | Various manufacturers | Laboratory grade | |
| Table 1. Reagents | |||
| Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader | Amersham Biosciences | For use with stop reaction method | |
| Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader | Bio-Tek Instruments, Inc. | For use with continuous kinetic monitoring | |
| Table 2. Equipment |
References
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay. Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).
- Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays. BMC Genomics. 10, 497 (2009).
- Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses. FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).
- D’Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway. J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).
- Underwood, K. F., D’Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity. J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).
- Held, P. Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations. Biotek Instruments Application Note. , (2007).
- Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Res. 29, E21 (2001).
- Pommier, Y. DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).
- Pennisi, E. Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA. Science. 337, 1159-1161 (2012).
