En kvantitativ analys för att studera protein: DNA-interaktioner, Discover transkriptionsregulatorer av genuttryck, och identifiera nya antitumörmedel
Summary
Vi utvecklade en kvantitativ DNA-bindning ELISA-baserad analys för att mäta transkriptionsfaktor interaktion med DNA. Hög specificitet för Runx2 protein uppnåddes med en konsensus-DNA-erkännande oligonukleotiden och specifik monoklonal antikropp. Kolorimetrisk detektion med en enzym-kopplad antikropp substratreaktionen övervakades i realtid.
Abstract
Många DNA-bindande analyser, såsom elektroforetisk mobilitetsförskjutningsanalyser (EMSA), kemiluminescenta analyser, kromatin immunoprecipitation (chip)-baserade analyser och flerbrunnsbaserade analyser används för att mäta transkriptionsfaktoraktivitet. Emellertid har dessa analyser är nonquantitative, saknar specificitet, kan innebära användning av radiomärkta oligonukleotider, och får inte vara anpassningsbar för screening av inhibitorer för DNA-bindning. Å andra sidan, med hjälp av en kvantitativ DNA-bindande enzym-linked immunosorbent assay (D-ELISA)-analys visar vi nukleära protein-interaktioner med DNA genom att använda Runx2 transkriptionsfaktor som beror på specifik association med konsensus-DNA-bindande sekvenser närvarande på biotin- märkta oligonukleotider. Framställning av celler, extraktion av nukleärt protein, och design av dubbelsträngade oligonukleotider som beskrivits. Avidin-belagda 96-brunnsplattor är fasta med alkalisk buffert och inkuberades med nukleära proteiner i nukleotid blockeringsbuffert. Follgrund omfattande tvättning av plattorna, specifik primär antikropp och sekundära inkubationer antikropps följt av tillsats av pepparrotsperoxidas-substrat och utveckling av den kolorimetriska reaktionen. Stopp reaktionssätt eller kontinuerlig kinetisk övervakning användes för att kvantitativt mäta protein interaktion med DNA. Vi diskuterar lämpliga specificitet kontroller, inklusive behandling med icke-specifikt IgG eller utan protein eller primär antikropp. Tillämpningar av analysen är beskrivna inklusive dess användbarhet vid läkemedelsscreening och representativa positiva och negativa resultat diskuteras.
Introduction
DNA-bindningsanalyser vara användbara vid mätning av förmågan hos transkriptionsfaktorer att interagera med DNA. Analyser för DNA-bindande inkluderar elektro mobilitet shift analyser (EMSA) som är beroende av radiomärkta oligonukleotider 1 eller kemiluminescens analyser 2. Kromatin immuneprecipitation (chip) baserade analyser 3 liksom analyser som utnyttjar 96-brunnars format 4 har också beskrivits. Dock är EMSA en icke-kvantitativ analys som kräver användning av radiomärkta oligonukleotider. När nukleära proteiner associerar med de specifika nukleotid promotorsekvenser, bindande komplex är efterbliven på polyakrylamidgeler och specifika transkriptionsfaktor kan valideras med en antikropp "supershift". Vi har utvecklat en kvantitativ DNA-bindningsanalys med användning av en enzymkopplad immunosorbent-format (D-ELISA), som är i stånd att mäta interaktionen av Runx2 med DNA-bindande sekvenser som motsvarar definierade promotorelement in Runx2 målgener. Användning av en anti-Runx2 antikropp ger specificitet till analysen och avsaknaden av radiomarkör särskilja denna analys från den traditionella gelskiftanalys 5. Detektion av bindningskomplex som är möjligt med användning av en sekundär antikropp kopplad till pepparrotsperoxidas (HRP), som konverterar ett HRP-substrat, tetrametylbensidin (TMB) till en färgad produkt för spektrofotometrisk analys. Analysen rapporteras här kan införliva användningen av muterade DNA-oligonukleotider som kontroller och kan användas för detektion av kompetitiva eller icke-kompetitiva hämmare av DNA-bindning. Screeningen av nya antitumörföreningar är också möjligt med denna analys.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA-bindande analyser används för att mäta förmågan hos transkriptionsfaktorer att interagera med DNA. Analyser med avseende på DNA-bindnings inkludera elektroforetisk rörlighet skift (EMSA) 1 och kromatin immuneprecipitation (chip) baserade analyser 3 liksom analyser som utnyttjar 96-brunnars format 4 såsom kemiluminiscenta analyser 2. Den EMSA är icke-kvantitativ och använder radioaktivt märkt (32 P) oligonukleotider. Dessa inkuberas med kärnproteiner …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Det tekniska stödet och instrumentering vid University of Maryland Greenebaum Cancer Center Translational Core Facility, särskilt Dr. Rena Lapidus och Mariola Sadowska är tacksamma. Verket ansvarar för utvecklingen av denna analys finansierades delvis av NIH RO1CA108846, AHA Grant-i-Stöd GRNT2130014, en VA Merit Award till AP, och vid universitetet i Maryland cigarett Restitution fonderna (CRF) tillhandahålls till Marlene & Stewart Greenebaum Cancer Center.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Poly dI/dC | GE Healthcare, Piscataway, NJ | US20539-5UN | 1 U ~50mg |
| RUNX2 antibody | MBL International Corp., Woburn, MA | D130-3 | 1 mg/ml |
| Fab-specific peroxidase conjugated antibody | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9917 | 7.1 mg/ml |
| TMB Substrate (tetramethyl benzidine) | EXALPHA Biologicals, Shirley, MA | X1189S | 100 ml |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 57995 | Plate-fixing |
| Sulfuric Acid | VWR, West Chester, PA | BDH-39922-1 | Stop solution |
| Multi-well plates | Greiner Bio-One, Basel, Switzerland | 655996 | Avidin-coated, black sides |
| HALT | Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL | 78440 | Protease and phosphatase inhibitors |
| Chemicals | Various manufacturers | Laboratory grade | |
| Table 1. Reagents | |||
| Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader | Amersham Biosciences | For use with stop reaction method | |
| Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader | Bio-Tek Instruments, Inc. | For use with continuous kinetic monitoring | |
| Table 2. Equipment |
References
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay. Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).
- Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays. BMC Genomics. 10, 497 (2009).
- Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses. FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).
- D’Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway. J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).
- Underwood, K. F., D’Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity. J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).
- Held, P. Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations. Biotek Instruments Application Note. , (2007).
- Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Res. 29, E21 (2001).
- Pommier, Y. DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).
- Pennisi, E. Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA. Science. 337, 1159-1161 (2012).
