Gen İfadesi DNA etkileşimleri, Discover Transkripsiyonlu Regülatörleri ve Roman Anti-tümör Ajanlar tanımlayın: Protein Eğitim için Kantitatif Testi
Summary
Bu DNA ile transkripsiyon faktörü etkileşimi ölçmek için nicel bir DNA-bağlayıcı ELISA bazlı bir deney geliştirilmiştir. Runx2 protein için yüksek spesifikliği, bir konsensüs DNA tanıma oligonükleotid ve özel bir monoklonal antikor ile elde edilmiştir. Bir enzim-bağlı antikor alt tabaka reaksiyonu ile kolorimetrik tespit gerçek zamanlı olarak izlenmiştir.
Abstract
Örneğin elektroforetik hareketlilik kayma deneyleri (EMSA), kemilüminesan deneyleri, kromatin immünopresipitasyon (çip) dayalı tahliller ve çukurlu bazlı tahliller gibi birçok DNA-bağlama deneyleri, transkripsiyon faktörü aktivitesinin ölçülmesi için kullanılır. Bununla birlikte, bu deneyler, nonquantitative olan özgüllük eksikliği, radyo-etiketli oligonükleotit kullanılmasını içerebilir ve bağlayıcı bir DNA inhibitörlerinin taranması için adapte olmayabilir. Öte yandan, bir sayısal DNA bağlayıcı enzim bağlı immünosorbent deneyi (ELISA D-) analizi kullanarak, biyotin-üzerinde mevcut olan konsensüs DNA-bağlayıcı dizileri ile özel bir birlikte bağlıdır Runx2 transkripsiyon faktörü kullanılarak DNA ile nükleer protein etkileşimlerini göstermek etiketli oligonükleotidler. Hücrelerin hazırlanması, nükleer protein ve çift sicimli oligonükleotidlerin tasarım çıkarma açıklanmıştır. Avidin kaplı 96 oyuklu plakalar, alkalin tampon maddesi ile tespit edilmiş ve nükleotid bloke edici tamponu içinde nükleer protein ile inkübe edilir. FollPlakaların geniş yıkama, spesifik birincil antikor ve ikincil antikor inkübasyonlar bağlı kolorimetrik reaksiyonun yaban turpu peroksidaz substrat ve gelişme eklenmesi ile takip edilmektedir. Reaksiyon durdurma modu veya sürekli kinetik izleme kantitatif protein DNA ile etkileşimi ölçmek için kullanıldı. Bu non-spesifik IgG ile ya da protein ya da primer antikor olmadan tedavisi dahil olmak üzere, uygun özgüllük kontroller, tartışır. Analizin Uygulamaları onun uyuşturucu taraması programı ve temsilci olumlu ve olumsuz sonuçlar tartışılmıştır dahil açıklanmıştır.
Introduction
DNA-bağlama deneyleri, DNA ile etkileşime transkripsiyon faktörlerinin yeteneğini ölçmek kullanılabilmektedir. DNA bağlanması için tahliller, radyo-etiketli oligonükleotidler 1 ya da kemiluminesan tahliller 2 bağlıdır elektroforetik mobilite kayma analizleri (EMSA) içerir. 96 oyuklu biçimleri kullanılarak 4 Kromatin immuneprecipitation (çip) dayalı tahliller 3 hem de deneyler de tarif edilmiştir. Bununla birlikte, radyo-etiketli EMSA oligonükleotitlerin kullanımını gerektirir olmayan bir kantitatif deneyidir. Nükleer proteinler, spesifik nükleotid promotör sekansları ile ortak olduğunda, bağlanma kompleksleri poliakrilamid jelleri üzerinde geciktirilir ve spesifik transkripsiyon faktörü, bir antikor "süperkayma" ile doğrulanabilir. Bu tanımlanan promotör elemanlara tekabül eden DNA-bağlayıcı dizileri ile Runx2 etkileşimini ölçmek mümkün olan bir enzim-bağlı immünosorbent biçimi (D-ELISA) kullanılarak kantitatif bir DNA-bağlama deneyi geliştirdik in Runx2 hedef genler. Bir anti-Runx2 antikorun kullanımı tahlile özgüllük sağlar ve radyo-etiketin yokluğu geleneksel jel kayma deneyi 5 Bu tahlil ayırt eder. Bağlayıcı komplekslerinin tespiti spektrofotometrik analiz için bir renkli ürüne bir HRP alt-tabaka, tetrametil benzimidin (TMB) dönüştürür turp peroksidaz (HRP) bağlı ikinci bir antikorun kullanılması ile mümkündür. Burada bildirilen deney, kontroller olarak mutasyona uğramış DNA oligonükleotitlerin kullanımı dahil olabilir ve bağlayıcı DNA rekabetçi veya rekabetçi olmayan inhibitörleri tespiti için de kullanılabilir. Yeni anti-tümör bileşiklerinin bu deneyde tarama ile de mümkündür.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA-bağlama deneyleri, DNA ile etkileşime transkripsiyon faktörlerinin yeteneğini ölçmek için kullanılır. DNA bağlanması için tahliller, elektroforetik mobilite kaydırma (EMSA) 1 ve kromatin immuneprecipitation (çip) dayalı tahliller, 3 ve 96 oyuklu formatları bu chemiluminescent 2 ile 4 kullanan tahliller bulunmaktadır. EMSA olmayan nicel ve radyo-etiketli (32 P) oligonükleotitler kullanılır. Bu, nükleer protein ile inkübe edilir ve bağlayıcı kompleks…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Teknik yardım ve University of Maryland Greenebaum Kanser Merkezi Translational Core Tesisleri'nde, özellikle Dr enstrümantasyon. Rena Lapidus ve Mariola SADOWSKA, müteĢekkiriz. Bu testin geliştirilmesi için sorumlu çalışma NIH RO1CA108846, AHA Grant-in-Aid GRNT2130014, AP bir VA Merit Ödülü, tarafından ve Maryland Sigara İade Fonlarının Üniversitesi (CRF) Marlene & Stewart sağlanan tarafından kısmen finanse edildi Greenebaum Kanser Merkezi.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Poly dI/dC | GE Healthcare, Piscataway, NJ | US20539-5UN | 1 U ~50mg |
| RUNX2 antibody | MBL International Corp., Woburn, MA | D130-3 | 1 mg/ml |
| Fab-specific peroxidase conjugated antibody | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9917 | 7.1 mg/ml |
| TMB Substrate (tetramethyl benzidine) | EXALPHA Biologicals, Shirley, MA | X1189S | 100 ml |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 57995 | Plate-fixing |
| Sulfuric Acid | VWR, West Chester, PA | BDH-39922-1 | Stop solution |
| Multi-well plates | Greiner Bio-One, Basel, Switzerland | 655996 | Avidin-coated, black sides |
| HALT | Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL | 78440 | Protease and phosphatase inhibitors |
| Chemicals | Various manufacturers | Laboratory grade | |
| Table 1. Reagents | |||
| Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader | Amersham Biosciences | For use with stop reaction method | |
| Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader | Bio-Tek Instruments, Inc. | For use with continuous kinetic monitoring | |
| Table 2. Equipment |
References
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay. Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).
- Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays. BMC Genomics. 10, 497 (2009).
- Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses. FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).
- D’Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway. J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).
- Underwood, K. F., D’Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity. J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).
- Held, P. Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations. Biotek Instruments Application Note. , (2007).
- Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Res. 29, E21 (2001).
- Pommier, Y. DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).
- Pennisi, E. Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA. Science. 337, 1159-1161 (2012).
