Un ensayo cuantitativo para estudiar proteínas: DNA Interacciones, reguladores Descubra transcripcional de la expresión génica, e identificar agentes antitumoral
Summary
Desarrollamos una unión a ADN, ensayo basado en ELISA cuantitativo para medir las interacciones de los factores de transcripción con el ADN. Alta especificidad para la proteína RUNX2 se logró con un oligonucleótido de ADN consenso de reconocimiento y el anticuerpo monoclonal específico. Detección colorimétrica con una reacción anticuerpo-enzima-sustrato acoplado se monitorizó en tiempo real.
Abstract
Muchos ensayos de unión de ADN-tales como ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA), ensayos de quimioluminiscencia, de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) a base de ensayos, y ensayos basados en pocillos múltiples se utilizan para medir la actividad del factor de transcripción. Sin embargo, estos ensayos son no cuantitativos, carecen de especificidad, pueden implicar el uso de oligonucleótidos radiomarcados, y pueden no ser adaptables para el cribado de inhibidores de la unión del ADN. Por otro lado, el uso de una unión a ADN ensayo cuantitativo inmunoabsorbente ligado a enzimas (D-ELISA), que demuestran las interacciones de proteínas nucleares con ADN utilizando el factor de transcripción RUNX2 que dependen de asociación específica con secuencias de unión al ADN consenso presentes en biotina- oligonucleótidos marcados. Preparación de las células, la extracción de proteína nuclear, y el diseño de oligonucleótidos de doble cadena se describen. Placas de 96 pocillos recubiertas con avidina se fijan con tampón alcalino y se incubaron con las proteínas nucleares en tampón de bloqueo de nucleótidos. Folldebido extenso lavado de las placas, el anticuerpo primario específico y las incubaciones de anticuerpos secundarios son seguidos por la adición de sustrato de peroxidasa de rábano picante y el desarrollo de la reacción colorimétrica. Modo de reacción de parada o un control cinético continuo se utilizaron para medir cuantitativamente la interacción de proteínas con el ADN. Se discuten controles de especificidad apropiadas, incluyendo el tratamiento con IgG no específica o sin proteína o anticuerpo primario. Aplicaciones del ensayo se describen incluyendo su utilidad en la detección de drogas y se discuten los resultados positivos y negativos representativos.
Introduction
Ensayos de unión al ADN tienen utilidad en la medición de la capacidad de los factores de transcripción para interactuar con el ADN. Los ensayos para ADN de unión incluyen ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA) que dependen de oligonucleótidos radiomarcados 1 o ensayos de quimioluminiscencia 2. Ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) basadas 3, así como ensayos que emplean formatos de 96 pocillos 4 también se han descrito. Sin embargo, la EMSA es un ensayo de no cuantitativa que requiere el uso de oligonucleótidos radiomarcados. Cuando las proteínas nucleares se asocian con las secuencias específicas de nucleótidos promotora, complejos de unión están retrasados en geles de poliacrilamida y el factor de transcripción específico puede ser validado con una "supershift" anticuerpo. Hemos desarrollado un ensayo de unión de ADN-cuantitativa utilizando un formato de inmunoabsorción ligado a enzimas (D-ELISA), que es capaz de medir la interacción de RUNX2 con secuencias de unión al ADN que corresponden a elementos promotores definidos igenes objetivo n RUNX2. El uso de un anticuerpo anti-RUNX2 proporciona especificidad para el ensayo y la falta de radiomarcador distinguir este ensayo a partir del ensayo de desplazamiento en gel tradicional 5. La detección de complejos de unión es posible con el uso de un anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa de rábano picante (HRP), que convierte un sustrato de HRP, tetrametil bencidina (TMB) en un producto coloreado para el análisis espectrofotométrico. El ensayo informado aquí puede incorporar el uso de oligonucleótidos de ADN mutadas como controles y se puede utilizar para la detección de inhibidores competitivos o no competitivos de la unión del ADN. La selección de compuestos antitumorales novedosos también es posible con este ensayo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ensayos de unión al ADN se utilizan para medir la capacidad de los factores de transcripción para interactuar con el ADN. Los ensayos para la unión del ADN incluyen cambio de la movilidad electroforética (EMSA) y 1 inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) ensayos basados 3, así como ensayos que emplean formatos de 96 pocillos 4 tales como ensayos quimioluminiscentes 2. La EMSA es no cuantitativa y utiliza radiomarcado (32 P) oligonucleótidos. Estos se…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La asistencia técnica y la instrumentación de la Universidad de Maryland Fondo para el Centro de Cáncer Greenebaum Traslacional Core, especialmente los Dres. Rena Lapidus y Mariola Sadowska, se agradece. El trabajo responsable de la elaboración de este ensayo fue financiado en parte por el NIH RO1CA108846, AHA Grant-in-Aid GRNT2130014, un Premio al Mérito VA a AP, y por la Universidad de Maryland de cigarrillos fondos de reembolso (CRF) proporcionada a la Marlene y Stewart Centro del Cáncer de Greenbaum.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Poly dI/dC | GE Healthcare, Piscataway, NJ | US20539-5UN | 1 U ~50mg |
| RUNX2 antibody | MBL International Corp., Woburn, MA | D130-3 | 1 mg/ml |
| Fab-specific peroxidase conjugated antibody | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9917 | 7.1 mg/ml |
| TMB Substrate (tetramethyl benzidine) | EXALPHA Biologicals, Shirley, MA | X1189S | 100 ml |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 57995 | Plate-fixing |
| Sulfuric Acid | VWR, West Chester, PA | BDH-39922-1 | Stop solution |
| Multi-well plates | Greiner Bio-One, Basel, Switzerland | 655996 | Avidin-coated, black sides |
| HALT | Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL | 78440 | Protease and phosphatase inhibitors |
| Chemicals | Various manufacturers | Laboratory grade | |
| Table 1. Reagents | |||
| Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader | Amersham Biosciences | For use with stop reaction method | |
| Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader | Bio-Tek Instruments, Inc. | For use with continuous kinetic monitoring | |
| Table 2. Equipment |
References
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