Efficiënte Agroinfiltration van planten voor High-level Tijdelijke expressie van recombinante eiwitten
Summary
Planten bieden een nieuw systeem voor de productie van farmaceutische eiwitten op commerciële schaal die is beter schaalbaar, kostenefficiënte en veilige dan de huidige expressie paradigma. In deze studie, rapporteren we een eenvoudig en handig, toch schaalbare aanpak van target-gen-bevattende introduceren<em> Agrobacterium tumefaciens</em> In planten voor eiwithoudende transiënte expressie.
Abstract
Zoogdiercelculturen is het belangrijkste platform voor de commerciële productie van humane vaccins en therapeutische eiwitten. Het kan echter niet voldoen aan de toenemende wereldwijde vraag naar geneesmiddelen vanwege de beperkte schaalbaarheid en hoge kosten. Planten hebben aangetoond dat een van de meest veelbelovende alternatieve farmaceutische productieplatforms die robuust, schaalbaar, goedkoop en veilig. De recente ontwikkeling van virus-gebaseerde vectoren is toegestaan snelle en hoog-niveau transiënte expressie van recombinant eiwitten in planten. Verder optimaliseren van de bruikbaarheid van het tijdelijke expressiesysteem, demonstreren we een eenvoudig, efficiënt en schaalbaar methodologie om target-gen dat Agrobacterium introduceren in plantenweefsel in deze studie. Onze resultaten geven aan dat zowel agroinfiltration spuit en vacuüm methoden hebben geleid tot de efficiënte introductie van Agrobacterium in bladeren en levenskrachtige twee fluorescerende eiwitten, GFP en DsRed. VoortsWe tonen de unieke voordelen van beide methoden. Spuit infiltratie is eenvoudig en dure apparatuur hoeft niet. Ook kan de flexibiliteit om ofwel infiltreren gehele verlaten met een doelgen, of genen van meerdere doelen voeren op een blad. Zo kan het worden gebruikt voor laboratoriumonderzoek expressie van recombinante eiwitten en voor verschillende eiwitten of vectoren waarin voor yield of expressie kinetiek. De eenvoud van de spuit infiltratie suggereert ook haar nut in de middelbare school en universiteit onderwijs voor het vak van de biotechnologie. Daarentegen, vacuüm infiltratie meer robuust en opgeschaald voor commerciële vervaardiging van farmaceutische eiwitten. Het biedt ook het voordeel van het kunnen plantensoorten die niet vatbaar is voor spuit infiltratie zoals sla en Arabidopsis zijn agroinfiltrate. Kortom, de combinatie van spuit en vacuüm agroinfiltration biedt onderzoekers en docenten een eenvoudige, efficiënte en robuustemethodologie voor transiënte eiwitexpressie. Het zal veel gemakkelijker de ontwikkeling van farmaceutische eiwitten en bevorderen van wetenschappelijk onderwijs.
Introduction
Sinds 1970 zijn planten onderzocht als alternatieven voor zoogdieren, insecten en bacteriële celculturen voor de commerciële productie van recombinant proteïnen en therapeutische eiwitten 1. Plant-gebaseerde systemen voor de expressie van biofarmaceutische producten hebben aangetoond belofte in de afgelopen jaren een aantal nieuwe behandelingen voor ziekten, zoals de ziekte van Gaucher 2, en aviaire influenza H5N1 3, succesvol zijn gebleken in klinische onderzoeken. De ontwikkeling van competente mechanismen voor recombinante eiwitexpressie in planten in de decennia aangezien deze eerste experimenten heeft het potentieel voor plantaardige systemen voor het huidige paradigma van eiwitproductie aanpassen voor drie primaire redenen. Ten eerste is er een opmerkelijke afname in kosten bij zoogdieren, insecten en bacteriële bioreactoren vereisen aanzienlijke opstartkosten, duur groeimedia en gecompliceerde processen voor stroomafwaartse zuivering 4. De oprichting van stabiele transgene plantlijnen laat hen ook om de schaalbaarheid van andere expressie systemen overtreffen als eiwit expressie planten kunnen worden geteeld en geoogst op een agrarische schaal 5. Ten tweede, plantaardige expressiesystemen het risico op het overdragen van een mens of dier pathogeen het eiwit tot expressie gastheer voor mensen te verminderen, waaruit superioriteit openbare veiligheid 6. Tenslotte planten gebruik van een eukaryoot endomembranesysteem dat vergelijkbaar zoogdiercellen, waardoor goede post-translationele modificatie van eiwitten zoals glycosylering en de montage van meerdere-subeenheideiwitten 7. Dit vermogen geeft plantaardige systemen voordat deze basis prokaryotische systemen, zoals bacteriën, aangezien een groter aantal farmaceutische recombinante eiwitten, waaronder monoklonale antilichamen (mAbs) hebben een ingewikkeldere structuur en vereisen uitgebreide posttranslationele modificaties of assembly 8.
Er zijn twee belangrijke passendpijn tot de uiting van recombinante eiwitten in planten. De eerste is de ontwikkeling van een transgene lijn stabiel, waarbij DNA dat codeert voor het doeleiwit wordt gekloneerd in een expressie cassette en ingevoerd om de nucleaire en chloroplastgenomen bedoeld. Daarbij, het vreemde DNA wordt erfelijk door opvolgende generaties en zorgt voor enorm verbeterde schaalbaarheid, veel verder dan die van andere systemen meningsuiting 1. Introductie van exogeen DNA aan het nucleaire genoom wordt gewoonlijk bereikt door Agrobacterium tumefaciens infectie van plantenweefsel of, minder vaak, door microprojectielbombardement van het weefsel 9. Plantenhormonen worden vervolgens gebruikt om differentiatie en groei van transgene plantenweefsel zoals wortels en bladeren induceren. Transformatie van de chloroplast genoom kan niet worden bereikt met A. tumefaciens, maar vertrouwt volledig op goud of wolfraam deeltjes bekleed met DNA afgevuurd ballistisch in plantencellen. De tweede methode van het uiten van recombinatient in planten is door tijdelijke expressie 10. In dit scenario worden virus afgeleide vectoren herbergen het gen van belang geleverd via A. tumefaciens tot volledig ontwikkelde planten door middel van een proces genaamd agroinfiltration. In plaats van integratie in het plantengenoom, wordt de geleverde genconstruct dan beginnen direct de tijdelijke productie van het gewenste eiwit, die kunnen worden geoogst en geïsoleerd na een korte incubatieperiode. Transiënte genexpressie biedt het voordeel van een grotere totale eiwit accumulatie en een verbeterde tijd eiwitproductie, zoals planten direct ongeveer 1-2 weken na oogsten agroinfiltration 11 zal zijn. Dit is aanzienlijk sneller dan de processen van productie, selectie, en de bevestiging van stabiele transgene plant lijnen, die enkele maanden kan duren tot een jaar. Dit is echter ook de beperking van het tijdelijke expressiesysteem, omdat het niet zal opleveren genetisch stabiele plantaardige lines die kunnen worden gebruikt om een zaadbank voor grootschalige commerciële productie genereren. Desondanks zijn methoden ontwikkeld om grootschalige tijdelijke expressie verbeteren. Hier laten we zien een methode van generatie van voorbijgaande proteïne-expressie Nicotiana benthamiana planten met behulp gedeconstrueerd virale vectoren door A. geleverd tumefaciens.
Twee belangrijke methoden ontwikkeld voor de levering van A. tumefaciens in plantenweefsel: bench schaal infiltratie via een injectiespuit en grootschalige infiltratie via de vacuümkamer. Beide protocollen worden beschreven met N. benthamiana, die nauw verwant is aan de gemeenschappelijke tabaksplant, zoals de waardplant voor transiënte expressie van twee fluorescerende eiwitten: het groen fluorescerend eiwit (GFP) van kwallen Aequorea Victoria en de rode fluorescente eiwit uit Discosoma koraal (DsRed) 12,13. N. benthamiana is de meest voorkomende waardplant voorrecombinant eiwit omdat het vatbaar is voor genetische transformatie kunnen grote hoeveelheden biomassa snel leveren en is een vruchtbare zaad producent opschaling productie 14. Een ander voordeel van N. benthamiana als gastheren voor eiwitexpressie is de beschikbaarheid van een verscheidenheid van expressievectoren 2,5. In deze studie, twee deconstructed virale vectoren, op basis van een tabak (TMV) RNA replicon systeem (MagnICON vectoren) en de andere zijn afgeleid van de boon yellow dwarf virus (BeYDV) DNA replicon systeem (geminiviral vectoren) 4,11, 15-18, worden gebruikt om het GFP en DsRed gen dragen en zal ze in N. benthamiana cellen via A. tumefaciens. Drie DNA constructen zullen worden gebruikt voor GFP en DsRed MagnICON expressie vectoren. Zij omvatten de 5 'module (pICH15879) bevattende de promoter en andere genetische elementen voor het aandrijven van de expressie van het doelwitgen, het 3'module die het gen van belang (Pich-GFP of Pich-DsRed) en het integrase module (pICH14011) codeert voor een enzym dat integreert de 5 'en 3' modules samen bij expressie 8,15. Drie DNA-constructen zijn ook nodig voor expressie met geminiviral vectoren. Naast de vectoren die replicon van het doelgen (pBYGFP of pBYDsRed), wordt een vector die codeert voor het replicatie-eiwit (pREP110) vereist voor de amplificatie van de doelwit replicon 11,14,16. Bovendien is de opname van een vector die codeert voor de silencing suppressor p19 van tomaat bossige stunt virus gewenst voor niveau doelwitgenexpressie hoog 11,16.
Er zijn over het algemeen drie belangrijke stappen voor de invoering van de genen van recombinante eiwitten in plantencellen door agroinfiltration waaronder plantengroei, A. tumefaciens cultuur voorbereiding, en infiltratie. Aangezien elke stap is essentieel voor het uiteindelijke succes van deze procedure, dus een gedetailleerde beschrijving van elk wordtzowel spuit infiltratie en vacuüm infiltratie hieronder.
Protocol
Representative Results
Discussion
De toenemende vraag naar eiwit gebaseerde geneesmiddelen wereldwijd vereisen nieuwe productieplatforms die robuust, schaalbaar, lage kosten en een kluisje. Planten hebben aangetoond dat een van de meest veelbelovende alternatieve productiesystemen voor farmaceutische productie eiwit. In de afgelopen jaren is de ontwikkeling van deconstructed virus gebaseerde vectoren transiënte expressie van eiwitten in planten, die sterk verbetert de snelheid en opbrengst van plantaardige expressiesystemen 2,10 ingeschakeld…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken R. Zon en andere studenten van Chen's Laboratorium voor hun bijdrage aan materiaal generatie planten. We danken ook dr. D. Green voor zijn steun van undergraduate onderzoek in de Universiteit van Technologie en Innovatie (CTI). Dit onderzoek werd mede ondersteund door NIH subsidie U01 AI075549 en 1R21AI101329 naar Q. Chen, en een SSE subsidie van CTI van de Arizona State University naar Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado, en J. Stahnke zijn undergraduate studenten ondersteund door de SSE subsidie.
Materials
| Reagents | |||
| GFP | Invitrogen | V353-20 | www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008 |
| DsRed | Clontech | 632152 | www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000 |
| MagnICON Vector | Icon Genetics | n/a | www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006 |
| Geminiviral Vector | Author’s Lab | n/a | See reference: Chen and He, et al 2011 |
| N. benthamiana | Author’s Lab | n/a | herbalistics.com.au |
| Agrobacterium tumefaciens strain gv3101 | Author’s Lab | n/a | See reference: Lai and Chen 2012 |
| LB Agar Carbenicillin-100, plates | Sigma | L0418 | www.sigmaaldrich.com |
| LB Agar Kanamycin-50, plates | Sigma | L0543 | www.sigmaaldrich.com |
| Magnesium sulfate hepa hydrate | Sigma | M2773-500 g | www.sigmaaldrich.com |
| Bacto-Tryptone | Fisher | 73049-73-7 | www.fishersci.com |
| Bacto Yeast Extract | Becton, Dickinson & CO. | REF 212750 | www.bd.com |
| Difco Nutrient Broth | Becton, Dickinson & CO. | REF 234000 | www.bd.com |
| MES hydrate Buffer | Sigma | M8250-1kg | www.sigmaaldrich.com |
| Carbenicillin | Sigma | C1613-1ML | www.sigmaaldrich.com |
| Kanamycin | Sigma | 70560-51-9 | www.sigmaaldrich.com |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 221465 | www.sigmaaldrich.com |
| Jack’s Fertilizer | Hummert International | Jul-25 | www.hummert.com |
| Equipment | |||
| Vacuubrand MD4 Vacuum Pump | Fisher | 13-878-113 | www.fishersci.com |
| Vacuum Air Regulator Valve | Fisher | NC9386590 | www.fishersci.com |
| Desiccator 12 1/8″ with O ring | Fisher | 08-594-15C | www.fishersci.com |
| 3 L Tub | Rubber-Maid | n/a | Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work |
| plate/shelf 230ML | Fisher | NC9489269 | www.fishersci.com |
| Peat Pellet | Hummert International | 14-2370-1 | www.hummert.com |
| Propagation Tray Dome | hydrofarm | 132052 | www.hydroponics.net |
| Propagaiton Tray | hydrofarm | 138758 | www.hydroponics.net |
| Virbo Hand Seeder | Gro-Mor INC | n/a | www.gro-morent.com |
| Flora Cart 4 shelf | Hummert International | 65-6924-1 | www.hummert.com |
| 15 ml Round Bottom Culture Tubes | Sigma | CLS430172-500EA | http://www.sigmaaldrich.com |
| Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | www.bio-rad.com |
| Spectrophotometer Cuvettes | Bio-Rad | 223-9950 | www.bio-rad.com |
| Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | www.usascientific.com |
| Benchtop Centrifuge | Bio-Rad | 166-0602EDU | www.bio-rad.com |
| Incubator/Shaker | Eppendorf | Excella E25 | www.eppendorf.com |
| Ultraviolet Light Model#: UVGL-25 | UVP | 95-0021-12 | www.uvp.com |
References
- Chen, Q., Mou, B., Scorza, R. . Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities – Essays by Experts. , 86-126 (2011).
- Chen, Q., Lai, H. Plant-derived virus-like particles as vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).
- Landry, N., et al. Preclinical and clinical development of plant-made virus-like particle vaccine against avian H5N1 influenza. PLoS One. 5, e15559 (2010).
- Lai, H., Chen, Q. Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations. Plant Cell Reports. 31, 573-584 (2012).
- Chen, Q. Expression and Purification of Pharmaceutical Proteins in Plants. Biological Engineering. 1, 291-321 (2008).
- Chen, Q. Turning a new leaf. European Biopharm. Rev. 2, 64-68 (2011).
- Chen, Q., Levine, M. M., et al. . New Generation Vaccines. , 306-315 (2009).
- Lai, H., et al. Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2419-2424 (2010).
- Buswell, S., Medina-Bolivar, F., Chen, Q., Van Cott, K., Zhang, C. Expression of porcine prorelaxin in transgenic tobacco. Annals of the New York Academy of Sciences. 1041, 77-81 (2005).
- Lico, C., Chen, Q., Santi, L. Viral vectors for production of recombinant proteins in plants. J. Cell. Physiol. 216, 366-377 (2008).
- Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Hum. Vaccin. 7, 331-338 (2011).
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97, 11984-11989 (2000).
- Lai, H., He, J., Engle, M., Diamond, M. S., Chen, Q. Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce. Plant Biotechnology Journal. 10, 95-104 (2012).
- Giritch, A., et al. Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706 (2006).
- Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714 (2009).
- Santi, L., et al. An efficient plant viral expression system generating orally immunogenic Norwalk virus-like particles. Vaccine. 26, 1846-1854 (2008).
- He, J., Lai, H., Brock, C., Chen, Q. A Novel System for Rapid and Cost-Effective Production of Detection and Diagnostic Reagents of West Nile Virus in Plants. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-10 (2012).
- Huang, Z., et al. High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system. Biotechnol. Bioeng. 106, 9-17 (2010).
- Kuta, D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4, 752-757 (2005).
- Phoolcharoen, W., et al. Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana. Plant Biotechnology Journal. 9, 807-816 (2011).
- Phoolcharoen, W., et al. A nonreplicating subunit vaccine protects mice against lethal Ebola virus challenge. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 20695-20700 (2011).
- Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S., Chen, Q. Norwalk virus-like particles as vaccines. Expert Rev. Vaccines. 9, 299-307 (2010).
- Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Adv. Tech. Biol. Med. 1, 103 (2013).
