Den<em> I ovo</em> CAM-assay som et Xenograftmodel til Sarkom
Summary
Den<em> In ovo</em> Chorioallantoide membran (CAM) er podet med friske sarkom-afledte tumorvæv, deres encellede suspensioner og permanente og forbigående fluorescensmærkede etablerede sarkom cellelinjer. Modellen anvendes til at studere graft-(rentabilitet, Ki67 proliferationsindeks, nekrose, infiltration) og vært (fibroblast infiltration, vaskulær indvækst) adfærd.
Abstract
Sarkom er en meget sjælden sygdom, der er heterogent i naturen, alle hæmmer udviklingen af nye behandlingsformer. Sarkom patienter er ideelle kandidater til skræddersyet medicin efter lagdeling, forklarer den nuværende interesse i at udvikle en reproducerbar og low-cost xenotransplantat model for denne sygdom. Den kyllingechorioallantoinmembranen membranen er en naturlig immundefekt vært stand til at opretholde podede væv og celler uden artsspecifikke restriktioner. Desuden er det let adgang, manipuleres og afbildes ved hjælp af optiske og fluorescens stereomikroskopserien. Histologi tillader endvidere detaljeret analyse af heterotypic cellulære interaktioner.
Denne protokol beskriver detaljeret in ovo podning af fosterhinder med friske sarkom-afledte tumorvæv, deres encellede suspensioner og permanente og forbigående fluorescensmærkede etablerede sarkom cellelinjer (Saos-2 og SW1353). Chick overlevelse rottees er op til 75%. Modellen anvendes til at studere graft-(rentabilitet, Ki67 proliferationsindeks, nekrose, infiltration) og vært (fibroblast infiltration, vaskulær indvækst) adfærd. For lokaliseret podning af encellede suspensioner, giver ECM gel betydelige fordele i forhold inaktive indeslutning materialer. Den Ki67 proliferationsindeks er relateret til afstanden af cellerne fra overfladen af modulet og varigheden af anvendelsen på CAM'en, sidstnævnte bestemmelse en tidsramme for tilsætning af terapeutiske produkter.
Introduction
Sarkom er en sjælden tumor i bindevæv med en høj dødelighed som følge af behandling modstand 1,2. Fremskridt i patientens overlevelse er hæmmet af deres lave årlige incidens, deres brede mangfoldighed, og det faktum at sarcomaceller rapporteres at være svært at kultur in vitro 3,4.
Brugen af dyrkede celler til præklinisk terapi evaluering har vist, at nye, tilsyneladende aktive molekyler in vitro ikke altid afspejler resultater i kliniske omgivelser. Endvidere genom aberrationer afsløret af genekspression arrays er ikke altid korreleret til tumor adfærd karakteristika i den enkelte patient 5-7. For at forsøge at løse disse problemer har skræddersyet medicin fået større betydning, hvilket afspejles i den øgede søgning efter xenograftmodeller 8-12.
Et in vivo-assay har den fordel afspejler komplekse samspil mellem Cancer celler og værtens væv miljø i solide tumorer, der er nødvendige for kræft spredning og invasion 13.. I øjeblikket vi undersøge anvendelsen af Chorio-allantoiske Membran assay (CAM-assay) som en reproducerbar xenograft model for sarkom 14,15. Dette assay er almindeligt anvendt til undersøgelse af tumorangiogenese 16,17. I litteraturen har vi imidlertid fundet forskellige protokoller for dette assay, mens andre studier observeret en markant forskel i vækst eller angiogenese i henhold til forskellige protokoller 18,19.
I denne artikel vil vi undersøge effekten af varierende betingelser for CAM-analysen på celle adfærd ved hjælp af tumor transplantater, tumorafledte encellede suspensioner og etablerede sarkom cellekulturer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidspunkt for podning og høst
Timing dagen for podning blev udført ved hjælp SAOS2 i ECM gel (36 CAMs) og varierede mellem fosterudviklingen dag 5 og 10.
Før inkubation dag 9, var CAM ikke konsekvent stor nok til at understøtte ECM gelen vi anvendte. Ved høst, undertiden tumorceller skulle hentes fra dybere CAM, og nogle ECM gelprøver lå løs i æggehviden eller på CAM. På dag 5 og 6, var det svært at undgå at tumorcellerne på hønseembryo, hvilket resu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Celler fra SW1353 chondrosarcoma cellelinje blev venligst stillet til rådighed af Prof. Dr. PCW Hogendoorn og Prof. Dr. J. Bovee af Leiden Universitet, Holland. Vi takker J. Mestach og G. Wagemans for fremragende teknisk bistand og G. De Bruyne til den professionelle tegning af overblik over vores protokol.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Amaxa | VCA-1003 |
| collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| Dnase solution | Sigma Aldrich | DN25 |
| G418 | Invitrogen | 11811031 |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 |
| mouse primary monoclonal antibody Ki67 | Dako Denmark | MIB-1 |
| Paraformaldehyde | Fluka | D76240 |
| PBS | Invitrogen | 20012019 |
| PBSD | Invitrogen | 14040083 |
| peGFP-C1 vector | Clontech | 632470 |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140163 |
| RPMI | Invitrogen | 22409-015 |
| Trypsin-EDTA solution | Invitrogen | 25300054 |
| Vybrant cell-labeling DiI | Lifetechnologies | 22885 |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 |
| digital color camera | Leica | DFC 340 FX |
| Digital Egg Incubator | Auto Elex Co | R-COM 50 |
| FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII |
| Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 |
| Gentlemacs Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 |
| Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol | Miltenyi Biotech | |
| semipermeable adhesive film (Suprasorb F) | Lohmann&Rauscher | 20468 |
| stereo fluorescence microscope | Leica | M205 FA |
| Tissue-Tek Film automated Coverslipper | Sakura | 6400 |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 |
| Ventana Automated Slide Stainer | Ventana Medical Systems | Benchmark XT |
References
- Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution. Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).
- Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al. Anticancer drug sensitivity and expression of multidrug resistance markers in early passage human sarcomas. Clinical Cancer Research. 5, 2198-2204 (1999).
- Greenlee, R. T., Hill-Harmon, M. B., Murray, T., Thun, M. Cancer statistics, 2001. CA A Cancer Journal for Clinicians. 51, 15-36 (2001).
- Gil-Benso, R., Lopez-Gines, C., et al. Establishment and characterisation of a continuous human chondrosarcoma cell line, ch-2879: Comparative histologic and genetic studies with its tumor of origin. Laboratory Investigations. 83, 877-887 (2003).
- Taylor, B. S., Barretina, J., et al. Advances in sarcoma genomics and new therpeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11, 541-557 (2011).
- Skubitz, K. M., D’Adamo, D. R. Sarcoma. Mayo Clinic Proceedings. 82, 1409-1432 (2007).
- Nielsen, T. O., West, R. B. Translating gene expression into clinical cara: sarcomas as a paradigm. Journal of Clinical Oncology. 28, 1796-1805 (2010).
- Vaira, V., Fedele, G., Pyne, S. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107, 8352-8356 (2010).
- DeRose, Y. S., Wang, G., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
- Tentler, J. J., Tan, A. C., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
- Bertotti, A., Migliardi, G., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts (“xenopatients”) identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
- Decaudin, D. Primary human tumor xenografted models (‘tumorgrafts’) for good management of patients with cancer. Anticancer Drugs. 22, 827-841 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Sys, G., Van Bockstal, M., et al. Tumor grafts derived from sarcoma patients tumor morphology, viability, and invasion potential and indicate disease outcomes in the chick chorioallantoic membrane model. Cancer Letters. 326, 69-78 (2012).
- Armstrong, P. B., Quigley, J. P., Sidebottom, E. Transepithelial invasion and intramesenchymal infiltration of the chick embryo chorioallantois by tumor cell lines. Recherche en cancérologie. 42, 1826-1837 (1982).
- Deryugina, E., Quigly, J. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130, 1119-1130 (2008).
- Knighton, D., Ausprunk, D., Tapper, D., Folkman, J. Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British Journal of Cancer. 35, 347-356 (1977).
- Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J. Vis. Exp. (33), e1620 (2009).
- Balke, M., Neumann, A., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Research Notes. 3, 58 (2010).
- Hendrix, A., Maynard, D., et al. Effect of the secretory small GTPase Rab27B on breast cancer growth, invasion, and metastasis. Journal of the National Cancer Institute. 102, 866-880 (2010).
- Ausprunk, D., Knighton, D., Folkman, J. Vascularization of normal and neoplastic tissues grafted to the chick chorioallantois: role of host and preexisting graft vessels. American Journal of Pathology. 79, 597-618 (1975).
- Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Riciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic membrane (CAM) Assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13, 9959-9970 (2012).
- Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 59, 1162-1176 (2007).
- Hagedorn, M., Javerzat, S., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 1643-1648 (2005).
- De Wever, O., Hendrix, A., et al. Modeling and quantification of cancer cell invasion through collagen type I matrices. International Journal of Developmental Biology. 54, 887-896 (2010).
- Albini, A., Benelli, R. The chemoinvasion assay: A method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation. Nature Protocols. 2, 504-511 (2007).
- Hanahan, D., Coussens, L. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
