Le<em> En ovo</em> CAM-test comme un Xenograftmodel pour le sarcome
Summary
Le<em> In ovo</em> Chorioallantoic membrane (CAM) est greffé avec des tissus frais sarcome dérivées de tumeurs, leurs suspensions cellulaires simples, et des lignées cellulaires établies sarcome marquées par fluorescence permanents et transitoires. Le modèle est utilisé pour étudier greffon (viabilité, Ki67 index de prolifération, nécrose, infiltration) et hôte (d'infiltration de fibroblastes, interposition vasculaire) comportement.
Abstract
Sarcome est une maladie très rare qui est de nature hétérogène, tout d'entraver le développement de nouvelles thérapies. patients atteints de sarcomes sont des candidats idéaux pour une médecine personnalisée après stratification, ce qui explique l'intérêt actuel pour l'élaboration d'un modèle de xénogreffe reproductible et à faible coût pour cette maladie. La membrane chorio poussin est un hôte immunodéprimé naturel capable de soutenir les tissus et les cellules greffées sans restrictions spécifiques à l'espèce. En outre, il est facilement accessible, manipulée et imagées par stéréomicroscopie optique et fluorescence. L'histologie permet une analyse plus détaillée des interactions cellulaires hétérotypiques.
Ce protocole décrit en détail l'in ovo greffe de la membrane chorio avec sarcome dérivés de tissus frais de tumeurs, leurs suspensions cellulaires simples, et les lignes permanentes et transitoires marqués par fluorescence établies cellules sarcome (Saos-2 et SW1353). La survie rat de poussines sont en hausse de 75%. Le modèle est utilisé pour étudier greffon (viabilité, Ki67 index de prolifération, nécrose, infiltration) et hôte (d'infiltration de fibroblastes, interposition vasculaire) comportement. Pour greffage localisé de suspensions cellulaires simples, gel ECM offre des avantages significatifs par rapport aux matériaux de confinement inertes. L'index de prolifération Ki67 est liée à la distance entre les cellules de la surface de la came et de la durée de l'application sur la came, celle-ci déterminant une période de temps pour l'addition de produits thérapeutiques.
Introduction
Sarcome est une tumeur rare du tissu conjonctif avec un taux de mortalité élevé dû à 1,2 résistance à la thérapie. Progrès dans la survie des patients est entravée par leur faible incidence annuelle, leur grande diversité, et le fait que les cellules de sarcome sont signalés à être difficile à la culture in vitro de 3,4.
L'utilisation de cellules en culture pour l'évaluation préclinique de thérapie a révélé que de nouvelles molécules, apparemment actif in vitro ne reflètent pas toujours les résultats dans le contexte clinique. En outre, les aberrations du génome révélées par des tableaux d'expression des gènes ne sont pas toujours en corrélation avec les caractéristiques de comportement de la tumeur chez le patient individuel 7.5. Pour tenter de résoudre ces problèmes, la médecine personnalisée a gagné en importance, ce qui se reflète dans l'augmentation de la recherche de modèles de xénogreffes 8-12.
Un essai in vivo a l'avantage de refléter l'interaction complexe entre ccellules ancer et de l'environnement de tissu de l'hôte dans les tumeurs solides, nécessaires à la prolifération du cancer et l'invasion 13. Actuellement, nous étudions l'utilisation de l'essai sur la membrane chorio-allantoïdien (CAM-test) comme un modèle de xénogreffe reproductible pour le sarcome 14,15. Ce test est largement utilisé pour l'étude de l'angiogenèse tumorale 16,17. Dans la littérature, cependant, nous avons trouvé des protocoles différents pour ce test, tandis que d'autres études ont observé une différence marquée de la croissance ou de l'angiogenèse selon différents protocoles 18,19.
Dans cet article, nous examinons l'effet des conditions de la CAM-dosage variable sur le comportement des cellules en utilisant des greffes tumorales, les suspensions de cellules uniques dérivées de tumeurs et de cultures cellulaires de sarcome établies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Moment de l'inoculation et la récolte
Chronométrant le jour de l'inoculation a été effectuée à l'aide SAOS2 en gel ECM (36 CAM) et variait entre embryonnaire journée de perfectionnement 5 et 10.
Avant le jour d'incubation 9, le CAM a pas toujours assez grand pour soutenir le gel ECM, nous avons appliqué. A la récolte, les cellules tumorales devaient parfois être récupérés à partir de la CAM profond, et quelques échantillons de gel ECM …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les cellules de la lignée cellulaire de chondrosarcome SW1353 ont été aimablement fournies par le professeur PCW Hogendoorn et Dr. J. Bovée de l'Université de Leiden, Pays-Bas. Nous remercions J. Mestach et G. Wagemans pour une excellente assistance technique et G. De Bruyne pour le dessin professionnel de la vue d'ensemble de notre protocole.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Amaxa | VCA-1003 |
| collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| Dnase solution | Sigma Aldrich | DN25 |
| G418 | Invitrogen | 11811031 |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 |
| mouse primary monoclonal antibody Ki67 | Dako Denmark | MIB-1 |
| Paraformaldehyde | Fluka | D76240 |
| PBS | Invitrogen | 20012019 |
| PBSD | Invitrogen | 14040083 |
| peGFP-C1 vector | Clontech | 632470 |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140163 |
| RPMI | Invitrogen | 22409-015 |
| Trypsin-EDTA solution | Invitrogen | 25300054 |
| Vybrant cell-labeling DiI | Lifetechnologies | 22885 |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 |
| digital color camera | Leica | DFC 340 FX |
| Digital Egg Incubator | Auto Elex Co | R-COM 50 |
| FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII |
| Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 |
| Gentlemacs Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 |
| Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol | Miltenyi Biotech | |
| semipermeable adhesive film (Suprasorb F) | Lohmann&Rauscher | 20468 |
| stereo fluorescence microscope | Leica | M205 FA |
| Tissue-Tek Film automated Coverslipper | Sakura | 6400 |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 |
| Ventana Automated Slide Stainer | Ventana Medical Systems | Benchmark XT |
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