Gli<em> In ovo</em> CAM-saggio come Xenograftmodel per Sarcoma
Summary
Gli<em> In ovo</em> Corioallantoidea membrana (CAM) si innesta con tessuti freschi sarcoma di derivazione tumorale, le sospensioni di cellule singole, e stabilite le linee cellulari del sarcoma fluorescente permanenti e transitori. Il modello è utilizzato per lo studio del trapianto (viabilità, indice di proliferazione Ki67, necrosi, infiltrazione) e host (fibroblasti infiltrazione, crescita interna vascolare) comportamento.
Abstract
Sarcoma è una malattia molto rara, che è di natura eterogenea, tutte ostacolando lo sviluppo di nuove terapie. Pazienti sarcoma sono candidati ideali per la medicina personalizzata dopo stratificazione, che spiega l'attuale interesse per lo sviluppo di un modello di xenotrapianto riproducibile e di basso costo per questa malattia. Il corioallantoidea membrana pulcino è un ospite immunodeficienti naturale in grado di sostenere i tessuti e le cellule innestate senza restrizioni specie-specifici. Inoltre, esso è facilmente accessibile, manipolato e ripreso con stereomicroscopia ottica e fluorescenza. Istologia permette ulteriori analisi dettagliata delle interazioni cellulari eterotipiche.
Questo protocollo descrive in dettaglio l'in ovo innesto della membrana corioallantoidea con sarcoma dei tessuti derivati freschi del tumore, le loro sospensioni di cellule singole, e stabilite le linee cellulari del sarcoma permanenti e transitori fluorescente (Saos-2 e SW1353). La sopravvivenza ratto pulcinoes sono fino al 75%. Il modello è utilizzato per lo studio del trapianto (viabilità, indice di proliferazione Ki67, necrosi, infiltrazione) e host (fibroblasti infiltrazione, crescita interna vascolare) comportamento. Per localizzata innesto di sospensioni di cellule singole, ECM gel offre vantaggi significativi rispetto ai materiali di contenimento inerti. L'indice di proliferazione Ki67 è legato alla distanza delle cellule dalla superficie della CAM e la durata della applicazione sul CAM, quest'ultimo determina un intervallo di tempo per l'aggiunta di prodotti terapeutici.
Introduction
Sarcoma è un tumore raro del tessuto connettivo con un alto tasso di mortalità a causa di terapia resistenza 1,2. I progressi nella sopravvivenza del paziente è ostacolato dalla loro bassa incidenza annuale, la loro grande diversità, e il fatto che le cellule del sarcoma sono segnalati per essere difficile da coltura in vitro 3,4.
L'uso di cellule in coltura per la valutazione preclinica terapia ha rivelato che le nuove molecole, apparentemente attivi in vitro non sempre riflettono i risultati in ambito clinico. Inoltre, aberrazioni genomiche rivelati da array di espressione genica non sono sempre correlati alle caratteristiche di comportamento tumorali nel singolo paziente 5-7. Per cercare di risolvere questi problemi, la medicina personalizzata ha acquistato importanza, che si riflette in una maggiore ricerca di modelli di xenotrapianto 8-12.
I test in vivo ha il vantaggio di riflettere la complessa interazione tra ccellule Ancer e dell'ambiente tessuto ospite in tumori solidi, necessari per la proliferazione del cancro e l'invasione 13. Attualmente si studia l'uso del dosaggio a membrana Chorio-allantoideo (CAM-assay) come un modello di xenotrapianto riproducibile per sarcoma 14,15. Questo saggio è ampiamente usato per lo studio di angiogenesi tumorale 16,17. In letteratura, tuttavia, abbiamo trovato protocolli diversi per questo test, mentre altri studi hanno osservato una marcata differenza nella crescita o angiogenesi secondo diversi protocolli 18,19.
In questo articolo analizziamo l'effetto delle condizioni del CAM-dosaggio variabile sul comportamento delle cellule tumorali utilizzando innesti, sospensioni di cellule singole derivate da tumore e colture cellulari sarcoma affermati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tempo di inoculazione e raccolto
Temporizzare il giorno di inoculazione è stata effettuata utilizzando SAOS2 in ECM gel (36 CAM) e variava tra lo sviluppo embrionale giorno 5 e 10.
Prima giornata di incubazione 9, il CAM non è stato sempre abbastanza grande per sostenere il gel ECM abbiamo applicato. Alla raccolta, le cellule tumorali a volte hanno dovuto essere recuperato dal CAM più profondo, e alcuni campioni di gel ECM giacevano sciolto nel albume o in CAM. N…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le cellule della linea cellulare SW1353 condrosarcoma sono stati gentilmente forniti dal Prof. Dr. PCW Hogendoorn e il Prof. Dr. J. Bovée di Leida, Paesi Bassi. Ringraziamo J. Mestach e G. Wagemans per l'eccellente supporto tecnico, e G. De Bruyne per il disegno professionale della panoramica del nostro protocollo.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Amaxa | VCA-1003 |
| collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| Dnase solution | Sigma Aldrich | DN25 |
| G418 | Invitrogen | 11811031 |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 |
| mouse primary monoclonal antibody Ki67 | Dako Denmark | MIB-1 |
| Paraformaldehyde | Fluka | D76240 |
| PBS | Invitrogen | 20012019 |
| PBSD | Invitrogen | 14040083 |
| peGFP-C1 vector | Clontech | 632470 |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140163 |
| RPMI | Invitrogen | 22409-015 |
| Trypsin-EDTA solution | Invitrogen | 25300054 |
| Vybrant cell-labeling DiI | Lifetechnologies | 22885 |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 |
| digital color camera | Leica | DFC 340 FX |
| Digital Egg Incubator | Auto Elex Co | R-COM 50 |
| FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII |
| Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 |
| Gentlemacs Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 |
| Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol | Miltenyi Biotech | |
| semipermeable adhesive film (Suprasorb F) | Lohmann&Rauscher | 20468 |
| stereo fluorescence microscope | Leica | M205 FA |
| Tissue-Tek Film automated Coverslipper | Sakura | 6400 |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 |
| Ventana Automated Slide Stainer | Ventana Medical Systems | Benchmark XT |
References
- Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution. Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).
- Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al. Anticancer drug sensitivity and expression of multidrug resistance markers in early passage human sarcomas. Clinical Cancer Research. 5, 2198-2204 (1999).
- Greenlee, R. T., Hill-Harmon, M. B., Murray, T., Thun, M. Cancer statistics, 2001. CA A Cancer Journal for Clinicians. 51, 15-36 (2001).
- Gil-Benso, R., Lopez-Gines, C., et al. Establishment and characterisation of a continuous human chondrosarcoma cell line, ch-2879: Comparative histologic and genetic studies with its tumor of origin. Laboratory Investigations. 83, 877-887 (2003).
- Taylor, B. S., Barretina, J., et al. Advances in sarcoma genomics and new therpeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11, 541-557 (2011).
- Skubitz, K. M., D’Adamo, D. R. Sarcoma. Mayo Clinic Proceedings. 82, 1409-1432 (2007).
- Nielsen, T. O., West, R. B. Translating gene expression into clinical cara: sarcomas as a paradigm. Journal of Clinical Oncology. 28, 1796-1805 (2010).
- Vaira, V., Fedele, G., Pyne, S. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107, 8352-8356 (2010).
- DeRose, Y. S., Wang, G., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
- Tentler, J. J., Tan, A. C., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
- Bertotti, A., Migliardi, G., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts (“xenopatients”) identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
- Decaudin, D. Primary human tumor xenografted models (‘tumorgrafts’) for good management of patients with cancer. Anticancer Drugs. 22, 827-841 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Sys, G., Van Bockstal, M., et al. Tumor grafts derived from sarcoma patients tumor morphology, viability, and invasion potential and indicate disease outcomes in the chick chorioallantoic membrane model. Cancer Letters. 326, 69-78 (2012).
- Armstrong, P. B., Quigley, J. P., Sidebottom, E. Transepithelial invasion and intramesenchymal infiltration of the chick embryo chorioallantois by tumor cell lines. Recherche en cancérologie. 42, 1826-1837 (1982).
- Deryugina, E., Quigly, J. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130, 1119-1130 (2008).
- Knighton, D., Ausprunk, D., Tapper, D., Folkman, J. Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British Journal of Cancer. 35, 347-356 (1977).
- Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J. Vis. Exp. (33), e1620 (2009).
- Balke, M., Neumann, A., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Research Notes. 3, 58 (2010).
- Hendrix, A., Maynard, D., et al. Effect of the secretory small GTPase Rab27B on breast cancer growth, invasion, and metastasis. Journal of the National Cancer Institute. 102, 866-880 (2010).
- Ausprunk, D., Knighton, D., Folkman, J. Vascularization of normal and neoplastic tissues grafted to the chick chorioallantois: role of host and preexisting graft vessels. American Journal of Pathology. 79, 597-618 (1975).
- Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Riciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic membrane (CAM) Assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13, 9959-9970 (2012).
- Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 59, 1162-1176 (2007).
- Hagedorn, M., Javerzat, S., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 1643-1648 (2005).
- De Wever, O., Hendrix, A., et al. Modeling and quantification of cancer cell invasion through collagen type I matrices. International Journal of Developmental Biology. 54, 887-896 (2010).
- Albini, A., Benelli, R. The chemoinvasion assay: A method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation. Nature Protocols. 2, 504-511 (2007).
- Hanahan, D., Coussens, L. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
