ザ<em>卵で</em肉腫のためXenograftmodelとして> CAMアッセイ
Summary
ザ<em>卵で</em>絨毛尿膜（CAM）は、新たな肉腫由来の腫瘍組織、それらの単一細胞懸濁液、および恒久および一時蛍光標識された確立された肉腫細胞株でグラフトされている。モデルは、移植片（生存能力、Ki67の増殖指数、壊死、浸潤）とホスト（線維芽細胞の浸潤、血管内殖）挙動を研究するために使用されます。
Abstract
肉腫は、すべての新しい治療法の開発を妨げ、自然の中で異質である非常にまれな疾患である。肉腫患者がこの病気のために再現性と低コストの異種移植モデルの開発で現在の関心を説明、成層後のオーダーメイド医療のための理想的な候補です。ニワトリ漿尿膜は、種特異的な制限なしにグラフトされた組織や細胞を維持することのできる自然な免疫不全宿主である。また、容易にアクセス、操作及び光と蛍光実体顕微鏡を用いて撮像される。組織学はさらに異型細胞間相互作用の詳細な分析を可能にします。
このプロトコルは、新鮮な肉腫由来の腫瘍組織、それらの単一細胞懸濁液と、恒久的かつ一時的な蛍光標識確立肉腫細胞株（SAOS-2、SW1353）と絨毛尿膜のグラフト卵で詳細に説明しています。ひよこ生存ラットESは75％アップしている。モデルは、移植片（生存能力、Ki67の増殖指数、壊死、浸潤）とホスト（線維芽細胞の浸潤、血管内殖）挙動を研究するために使用されます。単一細胞懸濁液の移植ローカライズについては、ECMゲルは不活性封じ込め材に比べて大きな利点を提供します。 Ki67の増殖指数は、CAMの表面からの細胞の距離とCAM、治療製品の添加の時間枠を決定し、後者上のアプリケーションの継続期間に関連する。
Introduction
肉腫は、治療抵抗1,2による高い死亡率と結合組織のまれな腫瘍である。患者の生存率の進歩は、その低い年間発生率、彼らの幅広い多様性、および肉腫細胞をin vitroで 3,4 での培養には難しいことがあると報告されているという事実によって妨げられている。
前臨床治療の評価のための培養細胞の使用は、 インビトロで新しい、明らかに活性な分子が常に臨床に結果を反映していないことを明らかにした。さらに、遺伝子発現アレイによって明らかにされたゲノム収差は常に5-7個々の患者の腫瘍の行動特性に相関はありません。これらの問題を試してみて、解決するために、パーソナライズされた薬は異種移植モデル8-12のために増加し、検索に反映されている重要で得ています。
インビボアッセイにおけるcの間の複雑な相互作用を反映するという利点を有する癌の増殖と浸潤13のために必要なアンサー細胞および固形腫瘍における宿主組織環境。現在、我々は肉腫14,15のため再現性の異種移植モデルとしてChorioの-尿膜アッセイ（CAMアッセイ）の使用を検討する。このアッセイは、広く腫瘍の血管新生16,17の研究のために使用される。他の研究では、異なるプロトコル18,19に従って成長や血管新生の著しい違いを観察しながら、文献で は、しかし、我々は、このアッセイのために、異なるプロトコルを発見した。
本稿では、腫瘍移植片、腫瘍由来の単一細胞懸濁液と確立された肉腫細胞培養物を用いた細胞の挙動にCAMアッセイの条件を変化させる効果を調べる。
Protocol
概要については、図1を参照してください腫瘍材料 1。腫瘍サンプルの取得と準備患者材料の使用については、倫理委員会の承認が必要であり、インフォームドコンセントは、患者から得られなければならない。 介入時の収穫代表材（最小1センチメートル3）、生検または肉腫の切除のどちらか。生検の?…
Representative Results
CAMの評価腫瘍移植片はCAM（ 図2A）に付着なる。患者材料からの単一細胞懸濁液は、頻繁に干し、やや隆起したプラーク（ 図2D）が表示されます。 CAMの切除後、膜のしわ（2Eと2Fの図 ）が発生をマーク。 商業細胞株についてプラークは細胞増殖を示す時間より不透明になる。 ECMゲル中の異なる細胞株は…
Discussion
接種と収穫時
接種の日はECMゲル（36カム）でSAOS2を使用して実行し、胚発生の5日目と10の間で変化させたタイミング。
インキュベーション9日の前に、CAMは一貫して私たちが適用されたECMゲルをサポートするのに十分な大きさではなかった。収穫では、腫瘍細胞は時々深いCAMから取得しなければならなかった、といくつかのECMゲルサンプルは、卵白やCAM?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SW1353軟骨肉腫細胞株由来の細胞を親切に教授PCW Hogendoornとライデン大学、オランダの教授J.Bovéeによって提供された。私たちは、プロトコルの概要の専門描画にJ. MestachとG. Wagemans優れた技術支援のために、そしてG.デBruyneに感謝します。
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Amaxa | VCA-1003 |
| collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| Dnase solution | Sigma Aldrich | DN25 |
| G418 | Invitrogen | 11811031 |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 |
| mouse primary monoclonal antibody Ki67 | Dako Denmark | MIB-1 |
| Paraformaldehyde | Fluka | D76240 |
| PBS | Invitrogen | 20012019 |
| PBSD | Invitrogen | 14040083 |
| peGFP-C1 vector | Clontech | 632470 |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140163 |
| RPMI | Invitrogen | 22409-015 |
| Trypsin-EDTA solution | Invitrogen | 25300054 |
| Vybrant cell-labeling DiI | Lifetechnologies | 22885 |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 |
| digital color camera | Leica | DFC 340 FX |
| Digital Egg Incubator | Auto Elex Co | R-COM 50 |
| FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII |
| Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 |
| Gentlemacs Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 |
| Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol | Miltenyi Biotech | |
| semipermeable adhesive film (Suprasorb F) | Lohmann&Rauscher | 20468 |
| stereo fluorescence microscope | Leica | M205 FA |
| Tissue-Tek Film automated Coverslipper | Sakura | 6400 |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 |
| Ventana Automated Slide Stainer | Ventana Medical Systems | Benchmark XT |
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Citer Cet Article
Sys, G. M., Lapeire, L., Stevens, N., Favoreel, H., Forsyth, R., Bracke, M., De Wever, O. The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522, doi:10.3791/50522 (2013).