La<em> En ovo</em> CAM-ensayo como un Xenograftmodel para el sarcoma
Summary
La<em> In ovo</em> Membrana corioalantoidea (CAM) se injerta con sarcoma de tejidos frescos derivados del tumor, sus suspensiones de células individuales, y estableció líneas celulares de sarcoma etiqueta fluorescente permanentes y transitorios. El modelo se utiliza para estudiar injerto (viabilidad, índice de proliferación Ki67, la necrosis, la infiltración) y el anfitrión (la infiltración de fibroblastos, crecimiento vascular) comportamiento.
Abstract
El sarcoma es una enfermedad muy rara que es de naturaleza heterogénea, todos obstaculicen el desarrollo de nuevos tratamientos. Pacientes con sarcomas son candidatos ideales para la medicina personalizada después de la estratificación, que explica el interés actual en el desarrollo de un modelo de xenotrasplante reproducible y de bajo costo para esta enfermedad. La membrana corioalantoidea de pollo es un anfitrión inmunodeficiente natural capaz de sostener los tejidos y las células injertadas sin restricciones específicas de la especie. Además, es de fácil acceso, manipulado y fotografiado usando microscopía estereoscópica óptica y de fluorescencia. Histología permite un análisis más detallado de las interacciones celulares heterotípicos.
Este protocolo se describe en detalle la in ovo de injerto de la membrana corioalantoidea con sarcoma de tejidos frescos derivados del tumor, sus suspensiones de células individuales, y la etiqueta fluorescente establecidos líneas celulares de sarcoma permanentes y transitorios (Saos-2 y SW1353). La rata de supervivencia de los pollueloses son hasta un 75%. El modelo se utiliza para estudiar injerto (viabilidad, índice de proliferación Ki67, la necrosis, la infiltración) y el anfitrión (la infiltración de fibroblastos, crecimiento vascular) comportamiento. Para localizada injerto de suspensiones de células individuales, ECM gel proporciona ventajas significativas sobre los materiales inertes de contención. El índice de proliferación Ki67 se relaciona con la distancia de las células de la superficie de la CAM y la duración de la aplicación sobre la CAM, este último la determinación de un marco de tiempo para la adición de productos terapéuticos.
Introduction
El sarcoma es un tumor poco frecuente de los tejidos conectivos con una alta mortalidad por 1,2 resistencia a la terapia. El progreso en la supervivencia del paciente se ve obstaculizada por su baja incidencia anual, su amplia diversidad, y el hecho de que las células del sarcoma son reportados a ser difícil de cultivo in vitro 3,4.
El uso de células cultivadas para la evaluación de la terapia preclínica ha puesto de manifiesto que, aparentemente nuevas moléculas activas in vitro no siempre reflejan los resultados en el entorno clínico. Por otra parte, las aberraciones del genoma reveladas por las matrices de expresión génica no siempre son correlacionados con características de comportamiento del tumor en el paciente individual 5-7. Con el fin de tratar de resolver estos problemas, la medicina personalizada ha ganado en importancia, lo que se refleja en el aumento de búsqueda de modelos de xenoinjertos 8-12.
Un ensayo in vivo tiene la ventaja de reflejar la compleja interacción entre cÁNCER células y el medio ambiente tejido del huésped en los tumores sólidos, que sean necesarias para la proliferación del cáncer y la invasión 13. Actualmente se estudia el uso de la prueba de la membrana corioalantoides (CAM-ensayo) como un modelo de xenotrasplante reproducible para el sarcoma 14,15. Este ensayo es ampliamente utilizado para el estudio de la angiogénesis tumoral 16,17. En la literatura, sin embargo, hemos encontrado diferentes protocolos para este ensayo, mientras que otros estudios se observó una marcada diferencia en el crecimiento o la angiogénesis de acuerdo con diferentes protocolos de 18,19.
En este artículo se investiga el efecto de la variación de las condiciones del ensayo-CAM en el comportamiento celular mediante injertos tumorales, suspensiones de células individuales derivados del tumor y los cultivos celulares de sarcoma establecidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tiempo de la inoculación y la cosecha
Medir el tiempo del día de la inoculación se realizó utilizando SAOS2 en gel de ECM (36 CAMs) y varió entre el desarrollo embrionario días 5 y 10.
Antes del día 9 de incubación, la CAM no fue siempre lo suficientemente grande para sostener el gel ECM se aplicó. En la cosecha, las células tumorales a veces tenían que ser recuperados de la CAM más profundo, y algunas muestras de gel ECM yacían sueltos en la albúmina …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Las células de la línea celular de condrosarcoma SW1353 fueron amablemente proporcionados por el Prof. Dr. PCW Hogendoorn y el Prof. Dr. J. Bovée de la Universidad de Leiden, Países Bajos. Damos las gracias a J. Mestach y G. Wagemans excelente para la asistencia técnica y G. De Bruyne para el dibujo profesional de la información general de nuestro protocolo.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Amaxa | VCA-1003 |
| collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| Dnase solution | Sigma Aldrich | DN25 |
| G418 | Invitrogen | 11811031 |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 |
| mouse primary monoclonal antibody Ki67 | Dako Denmark | MIB-1 |
| Paraformaldehyde | Fluka | D76240 |
| PBS | Invitrogen | 20012019 |
| PBSD | Invitrogen | 14040083 |
| peGFP-C1 vector | Clontech | 632470 |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140163 |
| RPMI | Invitrogen | 22409-015 |
| Trypsin-EDTA solution | Invitrogen | 25300054 |
| Vybrant cell-labeling DiI | Lifetechnologies | 22885 |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 |
| digital color camera | Leica | DFC 340 FX |
| Digital Egg Incubator | Auto Elex Co | R-COM 50 |
| FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII |
| Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 |
| Gentlemacs Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 |
| Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol | Miltenyi Biotech | |
| semipermeable adhesive film (Suprasorb F) | Lohmann&Rauscher | 20468 |
| stereo fluorescence microscope | Leica | M205 FA |
| Tissue-Tek Film automated Coverslipper | Sakura | 6400 |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 |
| Ventana Automated Slide Stainer | Ventana Medical Systems | Benchmark XT |
References
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