Den<em> I ovo</em> CAM-analys såsom en Xenograftmodel för Sarcoma
Summary
Den<em> I ovo</em> Korioallantoinmembranet (CAM) ympas med färska sarkom-härledda tumörvävnad, deras enda cellsuspensioner, samt permanenta och tillfälliga fluorescerande etablerade sarkom cellinjer. Modellen används för att studera graft-(livskraft, Ki67 proliferationsindex, nekros, infiltration) och värd (fibroblast infiltration, vaskulär inväxt) beteende.
Abstract
Sarkom är en mycket sällsynt sjukdom som är heterogen till sin karaktär, allt hämmar utvecklingen av nya terapier. Sarkom patienter är perfekta kandidater för personlig medicin efter stratifiering, förklarar den nuvarande intresse av att utveckla en reproducerbar och billig xenotransplantat modell för denna sjukdom. Den chick korioallantoismembranet är en naturlig immunodeficient värd kan upprätthålla ympade vävnader och celler utan artspecifika begränsningar. Dessutom är det lätt att komma åt, manipuleras och avbildas med optisk och fluorescens stereomikroskopi. Histologi tillåter även en detaljerad analys av heterotypiska cellulära interaktioner.
Detta protokoll beskriver i detalj i ovo ympning av korioallantoinmembranet med färska sarkom-härledda tumörvävnad, deras enda cellsuspensioner, samt permanenta och tillfälliga fluorescerande etablerade sarkom cellinjer (Saos-2 och SW1353). Den chick överlevnad råttaes är upp till 75%. Modellen används för att studera graft-(livskraft, Ki67 proliferationsindex, nekros, infiltration) och värd (fibroblast infiltration, vaskulär inväxt) beteende. För lokaliserad ympning av enkelcellsuspensioner, ger ECM gel betydande fördelar jämfört med inerta inneslutande material. Den Ki67 proliferationsindex är relaterad till avståndet mellan celler från ytan av CAM och varaktigheten av ansökan om CAM, den senare fastställa en tidsram för tillsättning av terapeutiska produkter.
Introduction
Sarkom är en sällsynt tumör i bindväv med en hög dödlighet i terapi motstånd 1,2. Framsteg i patientens överlevnad hämmas av deras låga årliga incidensen, deras breda mångfald, och det faktum att sarkomceller rapporteras vara svårt att odling in vitro 3,4.
Användningen av odlade celler för preklinisk terapi utvärdering har visat att nya, till synes aktiva molekyler in vitro inte alltid återspeglar resultat i klinisk miljö. Dessutom genomet avvikelser avslöjas av arrayer genuttryck är inte alltid korrelerade till tumoruppförande egenskaper hos den individuella patienten 5-7. För att försöka lösa dessa problem, har personlig medicin ökat i betydelse, vilket återspeglas i den ökade sökandet efter xenograft modeller 8-12.
Ett test in vivo har fördelen av att reflektera det komplexa samspelet mellan cancer celler och värdvävnaden miljön i solida tumörer, som är nödvändiga för cancer proliferation och invasion 13. För närvarande studerar vi användningen av Chorio-allantois membrananalys (CAM-assay) som en reproducerbar xenograftmodell för sarkom 14,15. Denna analys är allmänt används för studier av tumörangiogenes 16,17. I litteraturen har vi dock funnit olika protokoll för denna analys, medan andra studier observerade en markant skillnad i tillväxt eller angiogenes enligt olika protokoll 18,19.
I denna artikel kommer vi undersöka effekten av varierande förhållanden i CAM-analys på cellens beteende med hjälp av tumör transplantat, tumörhärledda ensamstående cellsuspensioner och etablerade sarkom cellkulturer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidpunkten för ympning och skörd
Timing dagen för ympning utfördes med användning SAOS2 i ECM-gel (36 CAMs) och varierade mellan embryonal utveckling dag 5 och 10.
Innan inkubation dag 9, var CAM inte konsekvent tillräckligt stor för att stödja ECM gelen vi tillämpat. Vid skörd, hade tumörceller ibland hämtas från djupare CAM, och vissa ECM gelproverna låg lös i äggvitan eller på CAM. På dag 5 och 6, var det svårt att undvika att tumörcellerna p?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Celler från SW1353 chondrosarcoma cellinje vänligen tillhandahållen av Prof. Dr PCW Hogendoorn och Prof. Dr J. Bovee av Leiden University, Nederländerna. Vi tackar J. Mestach och G. Wagemans för utmärkt tekniskt bistånd, och G. De Bruyne för professionell ritning av en översikt av våra protokoll.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Amaxa | VCA-1003 |
| collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| Dnase solution | Sigma Aldrich | DN25 |
| G418 | Invitrogen | 11811031 |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 |
| mouse primary monoclonal antibody Ki67 | Dako Denmark | MIB-1 |
| Paraformaldehyde | Fluka | D76240 |
| PBS | Invitrogen | 20012019 |
| PBSD | Invitrogen | 14040083 |
| peGFP-C1 vector | Clontech | 632470 |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140163 |
| RPMI | Invitrogen | 22409-015 |
| Trypsin-EDTA solution | Invitrogen | 25300054 |
| Vybrant cell-labeling DiI | Lifetechnologies | 22885 |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 |
| digital color camera | Leica | DFC 340 FX |
| Digital Egg Incubator | Auto Elex Co | R-COM 50 |
| FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII |
| Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 |
| Gentlemacs Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 |
| Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol | Miltenyi Biotech | |
| semipermeable adhesive film (Suprasorb F) | Lohmann&Rauscher | 20468 |
| stereo fluorescence microscope | Leica | M205 FA |
| Tissue-Tek Film automated Coverslipper | Sakura | 6400 |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 |
| Ventana Automated Slide Stainer | Ventana Medical Systems | Benchmark XT |
References
- Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution. Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).
- Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al. Anticancer drug sensitivity and expression of multidrug resistance markers in early passage human sarcomas. Clinical Cancer Research. 5, 2198-2204 (1999).
- Greenlee, R. T., Hill-Harmon, M. B., Murray, T., Thun, M. Cancer statistics, 2001. CA A Cancer Journal for Clinicians. 51, 15-36 (2001).
- Gil-Benso, R., Lopez-Gines, C., et al. Establishment and characterisation of a continuous human chondrosarcoma cell line, ch-2879: Comparative histologic and genetic studies with its tumor of origin. Laboratory Investigations. 83, 877-887 (2003).
- Taylor, B. S., Barretina, J., et al. Advances in sarcoma genomics and new therpeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11, 541-557 (2011).
- Skubitz, K. M., D’Adamo, D. R. Sarcoma. Mayo Clinic Proceedings. 82, 1409-1432 (2007).
- Nielsen, T. O., West, R. B. Translating gene expression into clinical cara: sarcomas as a paradigm. Journal of Clinical Oncology. 28, 1796-1805 (2010).
- Vaira, V., Fedele, G., Pyne, S. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107, 8352-8356 (2010).
- DeRose, Y. S., Wang, G., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
- Tentler, J. J., Tan, A. C., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
- Bertotti, A., Migliardi, G., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts (“xenopatients”) identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
- Decaudin, D. Primary human tumor xenografted models (‘tumorgrafts’) for good management of patients with cancer. Anticancer Drugs. 22, 827-841 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Sys, G., Van Bockstal, M., et al. Tumor grafts derived from sarcoma patients tumor morphology, viability, and invasion potential and indicate disease outcomes in the chick chorioallantoic membrane model. Cancer Letters. 326, 69-78 (2012).
- Armstrong, P. B., Quigley, J. P., Sidebottom, E. Transepithelial invasion and intramesenchymal infiltration of the chick embryo chorioallantois by tumor cell lines. Recherche en cancérologie. 42, 1826-1837 (1982).
- Deryugina, E., Quigly, J. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130, 1119-1130 (2008).
- Knighton, D., Ausprunk, D., Tapper, D., Folkman, J. Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British Journal of Cancer. 35, 347-356 (1977).
- Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J. Vis. Exp. (33), e1620 (2009).
- Balke, M., Neumann, A., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Research Notes. 3, 58 (2010).
- Hendrix, A., Maynard, D., et al. Effect of the secretory small GTPase Rab27B on breast cancer growth, invasion, and metastasis. Journal of the National Cancer Institute. 102, 866-880 (2010).
- Ausprunk, D., Knighton, D., Folkman, J. Vascularization of normal and neoplastic tissues grafted to the chick chorioallantois: role of host and preexisting graft vessels. American Journal of Pathology. 79, 597-618 (1975).
- Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Riciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic membrane (CAM) Assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13, 9959-9970 (2012).
- Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 59, 1162-1176 (2007).
- Hagedorn, M., Javerzat, S., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 1643-1648 (2005).
- De Wever, O., Hendrix, A., et al. Modeling and quantification of cancer cell invasion through collagen type I matrices. International Journal of Developmental Biology. 54, 887-896 (2010).
- Albini, A., Benelli, R. The chemoinvasion assay: A method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation. Nature Protocols. 2, 504-511 (2007).
- Hanahan, D., Coussens, L. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
