Marquage métabolique de leucine Rich Repeat Kinase 1 et 2 avec radioactifs Phosphate
Summary
Répétition riche en leucine kinases 1 et 2 (et LRRK1 LRRK2) sont des protéines à domaines multiples qui codent à la fois GTPase et domaines de kinase et qui sont phosphorylées dans les cellules. Ici, nous présentons un protocole d'étiqueter LRRK1 et LRRK2 dans les cellules avec 32 P orthophosphate, fournissant ainsi un moyen de mesurer leur niveau global de phosphorylation cellulaire.
Abstract
Leucine répétition riche kinases 1 et 2 (LRRK1 et LRRK2) sont des paralogues qui partagent une organisation de domaine similaire, comprenant un domaine de sérine-thréonine kinase, un Ras de protéines complexe domaine (ROC), une extrémité C-terminale de ROC domaine (COR), et riche en leucine et répétitions ankyrine-comme à l'extrémité N-terminale. Les rôles cellulaires précises de LRRK1 LRRK2 et n'ont pas encore été élucidé, mais LRRK1 a été impliquée dans la tyrosine kinase du récepteur de signalisation 1,2, tandis que la LRRK2 est impliquée dans la pathogenèse de la maladie de Parkinson 3,4. Dans ce rapport, nous présentons un protocole d'étiqueter les protéines LRRK1 et LRRK2 dans les cellules avec 32 P orthophosphate, fournissant ainsi un moyen de mesurer les niveaux de phosphorylation de l'ensemble de ces deux protéines dans les cellules. En résumé, l'affinité des protéines marquées LRRK sont exprimés dans des cellules HEK293T qui sont exposées à un milieu contenant 32 P-orthophosphate. Le 32 P-orthophosphate est assimilé par les cellules après seulement quelquesheures d'incubation et l'ensemble des molécules dans la cellule contenant des phosphates sont ainsi marqués radioactivement. Via l'étiquette d'affinité (3xflag) les protéines de LRRK sont isolés à partir d'autres composants cellulaires par immunoprécipitation. Les immunoprécipités sont ensuite séparés par SDS-PAGE, transféré sur des membranes et de l'analyse des phosphates incorporés PVDF est effectuée par autoradiographie (32 de signal P) et la détection de l'Ouest (signal de protéines) des protéines sur les blots. Le protocole peut être facilement adapté pour surveiller la phosphorylation de toute autre protéine qui peut être exprimée dans des cellules et isolé par immunoprécipitation.
Introduction
Leucine riche répétition kinases 1 et 2 (LRRK1 et LRRK2) sont paralogues multidomaines qui partagent une organisation de domaine similaire. Les deux protéines codent pour une séquence de GTPase apparenté à la famille Ras (Ras GTPases de complexes de protéines, ou ROC) ainsi que d'un C-terminal du domaine ROC (COR), classer efficacement les deux protéines de la famille des protéines ROCO 5,6. N-terminale du domaine tandem ROC-COR, les deux protéines codant pour le domaine répétitions riches en leucine ainsi que d'un domaine ankyrine-like, alors que seulement LRRK2 code pour un tatou supplémentaire domein 6-8. C-terminale de ROC-COR, les deux protéines partagent un domaine de sérine-thréonine kinase, tandis que seulement la LRRK2 code pour un domaine de WD40 dans la région C-terminale 8. Les rôles cellulaires précises de LRRK1 LRRK2 et n'ont pas encore été élucidé, mais LRRK1 a été impliquée dans la tyrosine kinase du récepteur de signalisation 1,2, tandis que les points de preuve génétique à un rôle de LRRK2 dans la pathogenèse de la maladie de Parkinson 3,4.
<pclass = "jove_content"> La phosphorylation des protéines est un mécanisme réglementaire commun dans les cellules. Par exemple, la phosphorylation peut être essentielle pour l'activation des enzymes ou pour le recrutement de protéines d'un complexe de signalisation. La phosphorylation de la LRRK2 cellulaire a été largement caractérisé et cartographie phosphosite a montré qu'une majorité des sites de phosphorylation cellulaire de se produire dans une grappe entre l'unité de répétition ankyrine et domaines riches en leucine de répétition 9-11. Bien LRRK1 sites de phosphorylation cellulaire n'ont pas encore été cartographiée, à l'aide de données provenant d'études phosphoprotéine coloration des taches de protéines de LRRK1 immunoprécipitée à partir des cellules COS7 suggère que la protéine LRRK1 est phosphorylé dans les cellules 12.Ce document fournit un protocole de base pour tester le niveau de phosphorylation général de LRRK1 et LRRK2 dans des lignées cellulaires en utilisant un marquage métabolique avec 32 P-orthophosphate. La stratégie globale est simple. Affinity marqué LRRK proteins sont exprimés dans des cellules HEK293T qui sont exposées à un milieu contenant 32 P-orthophosphate. Le 32 P-orthophosphate est assimilé par les cellules après quelques heures d'incubation et l'ensemble des molécules dans la cellule contenant des phosphates sont ainsi marqués radioactivement. Le marqueur d'affinité (de 3xflag) est ensuite utilisée pour isoler les protéines de LRRK d'autres composants cellulaires par immunoprécipitation. Les immunoprécipités sont ensuite séparés par SDS-PAGE, transféré sur des membranes et de l'analyse des phosphates incorporés PVDF est effectuée par autoradiographie (32 de signal P) et la détection de l'Ouest (signal de protéines) des protéines sur les blots.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce document fournit un protocole de base pour tester le niveau de phosphorylation général de LRRK1 et LRRK2 dans des lignées cellulaires en utilisant un marquage métabolique avec 32 P-orthophosphate. La stratégie globale est simple. Affinity LRRK protéines marquées sont exprimées dans des cellules HEK293T qui sont exposées à un milieu contenant 32 P-orthophosphate. Le 32 P-orthophosphate est assimilé par les cellules après quelques heures d'incubation et l'ensemble de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes également reconnaissants à la Fondation Michael J. Fox soutenir cette étude. Nous remercions la Fondation de la recherche – Flandre FWO (FWO G.0666.09, chercheuse senior pour la communion de JMT), l'IWT SBO/80020 projet Neuro-CIBLE, la KU Leuven (OT/08/052A et IOF-KP/07 / 001) pour leur soutien. Cette recherche a également été soutenu en partie par les Fonds Druwé-Eerdekens gérés par la Fondation Roi Baudouin pour JMT.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) | Invitrogen | 11971-025 | This medium contains no phosphates |
| Anti Flag M2 affiinty gel | Sigma | A2220 | For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426. |
| Extra thick blotting filter | Bio-Rad | 1703965 | |
| Ponceau S solution | Sigma | P7170 |
References
- Hanafusa, H. Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor. Nat Commun. 2, 158 (2011).
- Titz, B., et al. The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization. Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).
- Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson’s disease. Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).
- Taymans, J. M., Cookson, M. Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau. Bioessays. 32, 227-235 (2010).
- Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol Cell. 101, 183-191 (2009).
- Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. The Roco protein family: a functional perspective. FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).
- Marin, I. The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights. Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).
- Marin, I. Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2. J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).
- Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate. Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).
- Gloeckner, C. J., et al. Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2. J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).
- Nichols, R. J., et al. 14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson’s disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization. Biochem J. 430, 393-404 (2010).
- Greggio, E., et al. Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1. J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).
- Taymans, J. M. LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding. PLoS One. 6, 23207-23 (2011).
- Daniëls, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. J Neurochem. 116, 304-315 (2011).
- Civiero, L. Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers. PLoS One. 7, e43472 (2012).
- Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain. J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).
- Lewis, P. A. Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro. J Vis Exp. , (2012).
- Lobbestael, E. Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags. BMC Biotechnol. 10, 16 (2010).
- Davies, P., et al. Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies. Biochem J. , (2013).
- West, A. B. Parkinson’s disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity. Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).
- Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Sci Transl Med. 4, 164ra161 (2012).
- Li, X., et al. Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson’s disease. PLoS One. 6, e17153 (2011).
- Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).
