Metabólicas etiquetado de repeticiones ricas en leucina quinasas 1 y 2 con Radioactive Fosfato
Summary
Leucina ricos repetir las quinasas 1 y 2 (LRRK1 y LRRK2) son proteínas multidominio que codifican tanto GTPasa y dominios quinasa y que son fosforilados en las células. Aquí, se presenta un protocolo para etiquetar LRRK1 y LRRK2 en las células con 32 P ortofosfato, proporcionando así un medio para medir sus niveles generales de fosforilación celular.
Abstract
Leucina ricos repetir las quinasas 1 y 2 (LRRK1 y LRRK2) son paralogs que comparten un dominio organización similar, incluyendo un dominio quinasa serina-treonina, un dominio de Ras proteínas complejas (ROC), un C-terminal de dominio de la República de China (COR), y rica en leucina y repite-anquirina como en el extremo N-terminal. Las funciones celulares precisas de LRRK1 y LRRK2 aún no se han dilucidado, sin embargo LRRK1 ha sido implicado en la señalización del receptor de tirosina quinasa de 1,2, mientras que LRRK2 está implicada en la patogénesis de la enfermedad de Parkinson 3,4. En este informe, se presenta un protocolo para etiquetar las proteínas LRRK1 y LRRK2 en células con 32P-ortofosfato, proporcionando así un medio para medir los niveles generales de fosforilación de estas 2 proteínas en las células. En breve, la afinidad de las proteínas etiquetadas con LRRK se expresan en células HEK293T que están expuestas al medio que contiene 32 P-ortofosfato. El P-32-ortofosfato es asimilado por las células después de sólo unos pocoshoras de incubación y todas las moléculas en la celda que contiene fosfatos de ese modo se marcaron radiactivamente. A través de la etiqueta de afinidad (3xFLAG) las proteínas LRRK están aislados de otros componentes celulares por inmunoprecipitación. Los inmunoprecipitados se separan luego a través de SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF y análisis de los fosfatos incorporados se realiza por autorradiografía (32 señal P) y de detección de Western (señal de proteína) de las proteínas en las manchas. El protocolo puede ser fácilmente adaptado para controlar la fosforilación de cualquier otra proteína que se puede expresar en las células y se aisló por inmunoprecipitación.
Introduction
Leucina ricos repetir las quinasas 1 y 2 (LRRK1 y LRRK2) son paralogs multidominio que comparten un dominio organización similar. Ambas proteínas codifican una secuencia de GTPasa similar a la familia Ras de GTPasas (RAS de Proteínas del Complejo, o ROC), así como un C-terminal de dominio ROC (CDR), la clasificación de manera efectiva ambas proteínas a la familia de proteínas ROCO 5,6. N-terminal del dominio tándem ROC-COR, ambas proteínas codifican un dominio de repetición rica en leucina, así como un dominio de ankyrin como, mientras que sólo el LRRK2 codifica un armadillo adicional domein 6-8. C-terminal de la República de China-COR, ambas proteínas comparten un dominio quinasa serina-treonina, mientras que sólo LRRK2 codifica un dominio WD40 en la región C-terminal 8. Las funciones celulares precisas de LRRK1 y LRRK2 aún no se han dilucidado, sin embargo LRRK1 ha sido implicado en la señalización del receptor de tirosina quinasa de 1,2, mientras que la evidencia genética puntos a un papel para LRRK2 en la patogénesis de la enfermedad de Parkinson 3,4.
<pclase = "jove_content"> La fosforilación de proteínas es un mecanismo regulador común en las células. Por ejemplo, la fosforilación puede ser esencial para la activación de enzimas o para el reclutamiento de proteínas a un complejo de señalización. La fosforilación celular de LRRK2 ha sido caracterizado extensivamente y mapeo phosphosite ha mostrado una mayoría de los sitios de fosforilación celular tiene lugar en un clúster entre la repetición de anquirina y ricas en leucina repetir dominios 9-11. Aunque LRRK1 sitios de fosforilación celular aún no se han asignado, la evidencia de los estudios que utilizaron tinción fosfoproteína de manchas de proteína LRRK1 inmunoprecipitada a partir de células COS 7 sugiere que la proteína está fosforilada LRRK1 en las células 12.Este documento proporciona un protocolo básico para el ensayo de nivel de fosforilación general de LRRK1 y LRRK2 en líneas celulares mediante marcaje metabólico con 32P-ortofosfato. La estrategia general es sencillo. Affinity etiquetada LRRK proteins se expresan en células HEK293T que están expuestas al medio que contiene 32 P-ortofosfato. El P-32-ortofosfato es asimilado por las células después de sólo unas pocas horas de incubación y todas las moléculas en la célula que contienen fosfatos, por lo tanto marcado radiactivamente. La etiqueta de afinidad (3xFLAG) se utiliza a continuación para aislar las proteínas LRRK de otros componentes celulares por inmunoprecipitación. Los inmunoprecipitados se separan luego a través de SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF y análisis de los fosfatos incorporados se realiza por autorradiografía (32 señal P) y de detección de Western (señal de proteína) de las proteínas en las manchas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este documento proporciona un protocolo básico para el ensayo de nivel de fosforilación general de LRRK1 y LRRK2 en líneas celulares mediante marcaje metabólico con 32P-ortofosfato. La estrategia general es sencillo. Etiquetados por afinidad proteínas LRRK se expresan en células HEK293T que están expuestas al medio que contiene 32 P-ortofosfato. El P-32-ortofosfato es asimilado por las células después de sólo unas pocas horas de incubación y todas las moléculas en la célula …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
También damos las gracias a la Fundación Michael J. Fox apoyar este estudio. Agradecemos a la Fundación de Investigación – Flandes FWO (proyecto FWO G.0666.09, senior comunión investigador a JMT), el proyecto Neuro-META TVN SBO/80020, la Universidad Católica de Lovaina (OT/08/052A y IOF-KP/07 / 001) por su apoyo. Esta investigación también fue financiada en parte por el Fondo Druwe-Eerdekens gestionados por la Fundación Rey Balduino a JMT.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) | Invitrogen | 11971-025 | This medium contains no phosphates |
| Anti Flag M2 affiinty gel | Sigma | A2220 | For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426. |
| Extra thick blotting filter | Bio-Rad | 1703965 | |
| Ponceau S solution | Sigma | P7170 |
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