Metabolische Markierung von Leucin Rich-Repeat-Kinasen 1 und 2 mit radioaktivem Phosphat
Summary
Leucin-reichen Repeat-Kinasen 1 und 2 (LRRK1 und LRRK2) sind Multidomänen-Proteine, die sowohl GTPase und Kinase-Domänen kodieren, und die in Zellen phosphoryliert sind. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur LRRK1 und LRRK2 in Zellen mit 32 P-Orthophosphat zu kennzeichnen, wodurch ein Mittel, um ihre Gesamtzell Phosphorylierung zu messen bietet.
Abstract
Leucin-reichen Repeat-Kinasen 1 und 2 (LRRK1 und LRRK2) Paraloge, die eine ähnliche Domänenorganisation zu teilen, die eine Serin-Threonin-Kinasedomäne, einem Ras komplexer Proteine Domain (ROC), einer C-terminalen Domäne des ROC (COR), und Leucin-reichen und Ankyrin-Repeats, wie am N-Terminus. Die genaue Rolle der zellulären LRRK1 und LRRK2 müssen noch aufgeklärt werden, aber LRRK1 in Tyrosinkinase-Rezeptor-Signal 1,2 gebracht worden, während LRRK2 in der Pathogenese von Parkinson-Krankheit 3,4 gebracht. In diesem Bericht stellen wir ein Protokoll, um die LRRK1 und LRRK2-Proteine in Zellen, die mit 32 P-Orthophosphat zu kennzeichnen, wodurch ein Mittel, um die Gesamt Phosphorylierung dieser 2-Proteine in Zellen zu messen bietet. Kurz, getaggt Affinität LRRK Proteine in HEK293T Zellen, die Medium mit 32 P-Orthophosphat ausgesetzt sind, zum Ausdruck gebracht. Die 32 P-Orthophosphat von den Zellen assimiliert nach wenigenStunden Inkubation und alle Moleküle in der Zelle, die Phosphate sind dabei radioaktiv markiert. Über die Affinitätsmarkierung (3xflag) die LRRK Proteine von anderen zellulären Komponenten durch Immunpräzipitation isoliert. Immunpräzipitate werden dann über SDS-PAGE aufgetrennt, auf PVDF-Membranen und Analyse der enthaltenen Phosphate durch Autoradiographie (32 P-Signal) und Western-Detektion (Protein-Signal) der Proteine auf den Blots durchgeführt. Das Protokoll kann leicht angepasst werden, um die Phosphorylierung von einem anderen Protein, das in Zellen exprimiert wird und durch Immunpräzipitation isoliert werden kann, zu überwachen.
Introduction
Leucin rich repeat-Kinasen 1 und 2 (LRRK1 und LRRK2) sind Multidomänen-Paralogen, die eine ähnliche Domäne Organisation teilen. Beide Proteine kodieren, eine GTPase Sequenz ähnlich der Ras-Familie von GTPasen (Ras komplexer Proteine oder ROC) sowie einen C-terminalen Domäne des ROC (COR), effektiv Klassifizieren beide Proteine an den Proteinfamilie ROCO 5,6. N-Terminus der ROC-COR Domain Tandem, beide Proteine kodieren ein Leucin-reichen Repeat-Domäne sowie eine Ankyrin-ähnlichen Domäne, während nur LRRK2 kodiert eine zusätzliche Gürteltier domein 6-8. C-Terminus der ROC-COR, beide Proteine teilen eine Serin-Threonin-Kinase-Domäne, während nur LRRK2 kodiert ein WD40-Domäne in der C-terminalen Region 8. Die genaue Rolle der zellulären LRRK1 und LRRK2 müssen noch aufgeklärt werden, aber LRRK1 in Tyrosinkinase-Rezeptor-Signal 1,2 gebracht worden, während die genetische Beweise deuten auf eine Rolle von LRRK2 in der Pathogenese von Parkinson-Krankheit 3,4.
<pclass = "jove_content"> Die Phosphorylierung von Proteinen ist eine gemeinsame Regulationsmechanismus in den Zellen. Zum Beispiel kann die Phosphorylierung essentiell für die Aktivierung von Enzymen bzw. für die Einstellung von Proteinen mit einem Signalisierungs komplex sein. Die zelluläre Phosphorylierung von LRRK2 wurde umfassend charakterisiert und phosphosite Mapping hat eine Mehrheit der zellulären Phosphorylierungsstellen in einem Cluster zwischen der Ankyrin repeat und Leucin-reichen Wiederholungsdomänen auftreten 9-11 gezeigt. Obwohl LRRK1 zellulären Phosphorylierungsstellen noch nicht abgebildet werden, Beweise aus Studien mit Phosphoprotein-Färbung von Blots von immun LRRK1 Protein aus COS7-Zellen legt nahe, dass LRRK1 Protein in Zellen phosphoryliert 12.Dieses Papier stellt eine Basisprotokoll zum Testen von allgemeinen Phosphorylierung von LRRK2 LRRK1 und in Zelllinien unter Verwendung metabolische Markierung mit 32 P-Orthophosphat. Die Gesamtstrategie ist einfach. Affinity getaggt LRRK proteIns in HEK293T-Zellen, die einem Medium, das 32 P-Orthophosphat ausgesetzt sind ausgedrückt. Die 32 P-Orthophosphat durch die Zellen bereits nach wenigen Stunden Inkubation und alle Moleküle in der Zelle, die Phosphate assimiliert werden dabei radioaktiv markiert. Der Affinitäts-Tag (3xflag) wird dann verwendet, um die LRRK Proteine von anderen zellulären Komponenten durch Immunpräzipitation isoliert werden. Immunpräzipitate werden dann über SDS-PAGE aufgetrennt, auf PVDF-Membranen und Analyse der enthaltenen Phosphate durch Autoradiographie (32 P-Signal) und Western-Detektion (Protein-Signal) der Proteine auf den Blots durchgeführt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Papier stellt eine Basisprotokoll zum Testen von allgemeinen Phosphorylierung von LRRK2 LRRK1 und in Zelllinien unter Verwendung metabolische Markierung mit 32 P-Orthophosphat. Die Gesamtstrategie ist einfach. LRRK affinitätsmarkierten Proteine in HEK293T-Zellen, die einem Medium mit 32 P-Orthophosphat ausgesetzt sind, ausgedrückt. Die 32 P-Orthophosphat durch die Zellen bereits nach wenigen Stunden Inkubation und alle Moleküle in der Zelle, die Phosphate assimiliert werd…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind auch dankbar, dass der Michael J. Fox Foundation unterstützt diese Studie. Wir danken der Forschungsgemeinschaft – FWO Flandern (FWO Projekt G.0666.09, Senior Researcher Stipendium für JMT), die Binnenschifffahrt SBO/80020 Projekt Neuro-TARGET, die KU Leuven (OT/08/052A und IOF-KP/07 / 001) für ihre Unterstützung. Diese Forschung wurde zum Teil auch von den Fonds-Druwé Eerdekens von der König-Baudouin-Stiftung verwaltet JMT unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) | Invitrogen | 11971-025 | This medium contains no phosphates |
| Anti Flag M2 affiinty gel | Sigma | A2220 | For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426. |
| Extra thick blotting filter | Bio-Rad | 1703965 | |
| Ponceau S solution | Sigma | P7170 |
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