Metabolisk mærkning af Leucin Rich Gentag Kinaser 1 og 2 med Radioaktivt Fosfat
Summary
Leucin rich repeat kinaser 1 og 2 (LRRK1 og LRRK2) er Multidomain proteiner, som koder for både GTPase og kinase-domæner, og som er phosphoryleret i celler. Her præsenterer vi en protokol til at mærke LRRK1 og LRRK2 i celler med 32P orthophosphat, hvilket giver et middel til at måle deres samlede cellulære phophorylation niveauer.
Abstract
Leucin rich repeat kinaser 1 og 2 (LRRK1 og LRRK2) paraloger, der deler en lignende domæne organisation, herunder en serin-threonin kinase domæne, et Ras af komplekse proteiner domæne (ROC), en C-terminal af ROC domæne (COR), og leucin-rige og ankyrin-lignende gentagelser i den N-terminale ende. De præcise cellulære roller LRRK1 og LRRK2 er endnu ikke klarlagt, men LRRK1 har været impliceret i tyrosinkinasereceptor signalering 1,2, mens LRRK2 er impliceret i patogenesen af Parkinsons sygdom 3,4. I denne rapport præsenterer vi en protokol at mærke LRRK1 og LRRK2 proteiner i celler med 32P orthophosphat, hvilket giver et middel til at måle de overordnede phosphoryle niveauer af disse 2 proteiner i cellerne. I korte træk affinitetsmærkede LRRK proteiner udtrykkes i HEK293T celler, som er udsat for medium indeholdende 32P-orthophosphat. Den 32 P-orthophosphat er ligestillet med cellerne efter kun et partimers inkubation og alle molekyler i cellen med fosfater derved radioaktivt mærket. Via affinitetsmærke (3xflag) de LRRK proteiner isoleres fra andre cellulære komponenter ved immunopræcipitation. Immunpræcipitater separeres derefter via SDS-PAGE, blottet til PVDF-membraner og analyse af de inkorporerede fosfater udføres ved autoradiografi (32P signal) og western detektion (protein signal) af proteinerne på blottene. Protokollen kan let tilpasses til at overvåge phosphorylering af ethvert andet protein, der kan udtrykkes i celler og isoleres ved immunopræcipitation.
Introduction
Leucin rich repeat kinaser 1 og 2 (LRRK1 og LRRK2) er Multidomain paraloger, der deler en lignende domæne organisation. Begge proteiner koder for et GTPase-sekvens beslægtet med Ras familien af GTPaser (Ras af komplekse proteiner eller ROC) samt en C-terminal ROC domæne (COR), effektivt klassificering begge proteiner til ROCO-proteinfamilien 5,6. N-terminalen af ROC-COR domæne tandem, begge proteiner koder en leucin-rige repeat-domænet samt en ankyrin-lignende domæne, mens kun LRRK2 koder for et ekstra bæltedyr Domein 6-8. C-terminalen af ROC-COR, begge proteiner deler en serin-threonin kinase domæne mens kun LRRK2 koder for et WD40 domæne i C-terminal området 8. De præcise cellulære roller LRRK1 og LRRK2 er endnu ikke klarlagt, men LRRK1 har været impliceret i tyrosinkinasereceptor signalering 1,2, mens den genetiske beviser peger på en rolle for LRRK2 i patogenesen af Parkinsons sygdom 3,4.
<pclass = "jove_content"> fosforylering af proteiner er en fælles reguleringsmekanisme i celler. For eksempel kan phosphorylering være afgørende for aktivering af enzymer eller til ansættelse af proteiner til en signalering kompleks. Den cellulære phosphorylering af LRRK2 er blevet grundigt karakteriseret og phosphosite kortlægning har vist et flertal af cellulær phosphoryleringssteder at forekomme i en klynge mellem ankyrin gentagelse og leucin rige gentagne domæner 9-11. Selvom LRRK1 cellulære phosphoryleringssites er endnu ikke kortlagt, dokumentation fra undersøgelser ved hjælp phosphoprotein farvning af blots af immunoprecipiteret LRRK1 protein fra COS7-celler tyder på, at LRRK1 protein phosphoryleres i celler 12.Dette papir giver en grundlæggende protokol for analyse generel fosforylering niveau LRRK1 og LRRK2 i cellelinjer hjælp metabolisk mærkning med 32P-orthophosphat. Den overordnede strategi er ligetil. Affinitetsmærkede LRRK proteins udtrykkes i HEK293T celler, som er udsat for medium indeholdende 32P-orthophosphat. Den 32 P-orthophosphat er ligestillet med cellerne efter kun et par timers inkubation og alle molekyler i cellen med fosfater derved radioaktivt mærket. Affinitetsmærket (3xflag) anvendes derefter til at isolere LRRK proteiner fra andre cellulære komponenter ved immunopræcipitation. Immunpræcipitater separeres derefter via SDS-PAGE, blottet til PVDF-membraner og analyse af de inkorporerede fosfater udføres ved autoradiografi (32P signal) og western detektion (protein signal) af proteinerne på blottene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette papir giver en grundlæggende protokol for analyse generel fosforylering niveau LRRK1 og LRRK2 i cellelinjer hjælp metabolisk mærkning med 32P-orthophosphat. Den overordnede strategi er ligetil. Affinitetsmærkede LRRK proteiner udtrykkes i HEK293T celler, som er udsat for medium indeholdende 32P-orthophosphat. Den 32 P-orthophosphat er ligestillet med cellerne efter kun et par timers inkubation og alle molekyler i cellen med fosfater derved radioaktivt mærket. Affinitetsmærket…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er også taknemmelig for, at Michael J. Fox Foundation støtter denne undersøgelse. Vi takker Research Foundation – Flandern FWO (FWO projekt G.0666.09, seniorforsker stipendium til JMT) IWT SBO/80020 projektet Neuro-TARGET, KU Leuven (OT/08/052A og IOF-KP/07 / 001) for deres støtte. Denne forskning blev også delvist understøttet af fondens Druwé-Eerdekens forvaltes af Kong Baudouin Foundation til JMT.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) | Invitrogen | 11971-025 | This medium contains no phosphates |
| Anti Flag M2 affiinty gel | Sigma | A2220 | For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426. |
| Extra thick blotting filter | Bio-Rad | 1703965 | |
| Ponceau S solution | Sigma | P7170 |
References
- Hanafusa, H. Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor. Nat Commun. 2, 158 (2011).
- Titz, B., et al. The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization. Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).
- Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson’s disease. Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).
- Taymans, J. M., Cookson, M. Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau. Bioessays. 32, 227-235 (2010).
- Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol Cell. 101, 183-191 (2009).
- Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. The Roco protein family: a functional perspective. FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).
- Marin, I. The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights. Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).
- Marin, I. Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2. J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).
- Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate. Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).
- Gloeckner, C. J., et al. Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2. J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).
- Nichols, R. J., et al. 14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson’s disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization. Biochem J. 430, 393-404 (2010).
- Greggio, E., et al. Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1. J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).
- Taymans, J. M. LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding. PLoS One. 6, 23207-23 (2011).
- Daniëls, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. J Neurochem. 116, 304-315 (2011).
- Civiero, L. Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers. PLoS One. 7, e43472 (2012).
- Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain. J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).
- Lewis, P. A. Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro. J Vis Exp. , (2012).
- Lobbestael, E. Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags. BMC Biotechnol. 10, 16 (2010).
- Davies, P., et al. Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies. Biochem J. , (2013).
- West, A. B. Parkinson’s disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity. Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).
- Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Sci Transl Med. 4, 164ra161 (2012).
- Li, X., et al. Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson’s disease. PLoS One. 6, e17153 (2011).
- Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).
