Visualisering av Kraniofacial Development i sox10: kaede Transgenic Sebrafisk linjen ved hjelp av Time-lapse konfokalmikroskopi

Summary

Visualisering av eksperimentelle data har blitt et sentralt element i å presentere resultatene til det vitenskapelige samfunn. Generering av levende intervallopptak av voksende embryo bidrar til bedre presentasjon og forståelse av komplekse utviklingsprosesser. Denne protokollen er en steg-for-steg guide til celle merking via photoconversion av kaede protein i sebrafisk.

Abstract

Virveldyr palatogenesis er en svært koreograferte og komplekse utviklingsprosess, som innebærer flytting av kranie neural crest (CNC) celler, konvergens og utvidelse av ansikts prominenser, og modning av kraniofaciale skjelettet. Å studere bidraget fra kranie neural crest til spesifikke regioner av sebrafisk ganen en sox10: kaede transgen sebrafisk linjen ble generert. Sox10 gir lineage begrensning av kaede rapportørprotein til neural crest, og dermed gjøre cellen merking en mer nøyaktig måte enn ved tradisjonell fargestoff eller reporter mRNA injeksjon. Kaede er en foto-konvertible protein som svinger fra grønt til rødt etter bilde aktivering og gjør det mulig å følge celler presist. De sox10: kaede transgene linjer ble brukt til å utføre avstamning analyse for å avgrense CNC celle populasjoner som gir opphav til overkjevens versus underkjevens elementer og illustrerer homologi av ansikts prominenser til amniotes. Denne protokollen beskriver trinns for å generere en live time-lapse video av en sox10: kaede sebrafisk embryo. Utvikling av ethmoid plate vil fungere som et praktisk eksempel. Denne protokollen kan brukes til å lage en time-lapse confocal opptak av noen kaede eller lignende photoconvertible reporter protein i transgen sebrafisk. Videre kan den brukes til å fange opp ikke bare normalt, men også unormal utvikling av craniofacial strukturer i sebrafisk mutanter.

Introduction

Orofacial kløfter representerer den mest utbredte kraniofaciale misdannelse, med 1/700-1, 000 leveranser påvirket ^en. Forstyrrelse av tidlig embryologisk kraniofaciale utvikling kan føre til dannelse av leppe-og ganespalte (CL / P). Mens årsaker til syndrom kløft har vært i stor grad vist, genetiske og epigenetiske baser av nonsyndromic former for orofacial clefting fortsatt trenger å bli avdekket ^2-4. For å forstå den etiologi og patogenese av disse deformasjoner, er det nødvendig å klargjøre utvikling av craniofacial strukturer på cellebasis.

I alle virveldyr arter hjerne neural crest cellene (CNCC) migrere fra dorsal nevralrøret å fylle svelg buer, som vil bidra til dannelsen av orofacial strukturer. Forstyrrelse av tidlig embryologisk neural crest utvikling kan føre til dannelse av kraniofaciale misdannelser inkludert CL / P ^5-7.

I annonsendition til strukturelle likheter mellom sebrafisk og pattedyr kraniofaciale utvikling (CNCCs bor i homologe regioner), er genet regulatoriske nettverk svært konservert. Det har også blitt vist at CNCCs utvikles på samme måte mellom amniote arter og sebrafisk ^8, noe som gjør en kraftig sebrafisk organisme for studiet av utviklings-og genetiske basis av CL / P. Det har mange fordeler, blant annet liten størrelse, rask og ex-utero embryoutvikling, og høye reproduksjons. Videre er embryo optisk transparent, slik at det er mottagelig for observasjon av komplekse utviklingshendelser i mikroskop ^9.. Det er en ideell dyremodell for studiet av migrasjon og differensiering av kranie neural crest cellene.

Utvider på tidligere publiserte arbeider ^{8, 10, 11,} den vandrende mønster av CNCC ble beskrevet i detalj ved hjelp av sox10: kaede transgen modell ^5. Kaede er en foto-konvertible protein som tuRNS fra grønt til rødt etter fotoaktivering og gjør det mulig å spore CNCCs presist. I løpet av denne transformasjonen peptid ryggrad spaltes, noe som tyder på at konverteringen er stabil, noe som betyr at cellene kan spores til sin endelige destinasjon ^12. Transgene linjer merket med kaede henhold transcriptional kontroll av sox10 viste at amniote gane og ethmoid plate av sebrafisk er dannet homologously ved fusjon av bilaterale overkjevens prominenser (MXP) med frontonasal prominens (FNP) og at Y-formet fusjon søm er analogt mellom arter.

Blant andre programmer, de sox10: ble kaede transgen sebrafisk modell brukes til å generere videoer av sebrafisk embryo på ulike utviklingsstadier vise dannelsen av normale og unormale kraniofaciale strukturer. Photoconversion av spesifikke grupper av celler gjør det mulig å følge utviklingen av disse. Med denne metoden en tilnærming for å skape levende avbildning av å utvikle craniofacial strukturer i sebrafisk er innført, noe som gjør det enkelt å visuelt demonstrere dette komplekset utviklingsprosess.

Denne protokollen er rettet mot å dele opplevelsen av å generere disse videoene ved hjelp av den normale utviklingen av ethmoid plate i sox10: kaede transgen sebrafisk som et eksempel. Denne protokollen kan videre brukes til å lage time-lapse videoer av noen struktur avledet fra kranie neural crest cellene i sebrafisk.

Protocol

En. Embryo Collection for Photoconversion Sett opp minst ti par sox10: kaede transgen sebrafisk mellom 5 og 18:00 i kveld. Den neste morgen, trekke skillevegger og samle egg utpå formiddagen. Overfør dem til petriskåler og sette dem inn 28.5 ° C inkubator. På rundt 24 timer etter befruktning, rengjøre petriskåler ved å fjerne døde embryoer. Sjekk utviklingsstadiet av embryoer 13 ved hjelp av lys felt mikroskopi og fluorescerende mikroskop med forbedret grønt fluorescer…

Representative Results

I sox10: kaede transgen linje, trekkende og etter trekkende CNCCs er merket fluorescerende grønne. CNCC celler merket med grønt fluorescerende kaede rekapitulere endogen sox10 mRNA uttrykk fem. Blant andre programmer, ble denne dyremodell som brukes for å bedre visualisere utviklingen av CNCC avhengige kraniofaciale strukturer. Normal utvikling av konkrete strukturer og også patologisk utvikling av kraniofaciale misdannelser, spesielt leppe og gane har blitt fanget. En rekke l…

Discussion

Her en ny metode for visualisering av kraniofaciale utvikling i sebrafisk-modellen vises. De sox10: kaede transgen sebrafisk linje har blitt brukt for å beskrive den vandrende mønster av CNCC i detalj er brukt som modellorganisme ^fem.

Tidligere studier har brukt brutto landemerker som øyet å målrette celler og har stolt på kaede mRNA injeksjon, photoconversion analyser eller bur fluorescein dekstran for photoconversion ^{10, 11, 14, 15} Sox:. 10 kaede transgen linje …

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
sox10: kaede transgenic zebrafish line	MGH		Available via the Liao lab
Petri dishes 100×15 mm	BD Falcon	351029
Petri dishes 35 mmx10 mm	BD Falcon	351008
Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose	Invitrogen	15517022
Lab Tek 2 Chamber SlideSystem	LabTek	154453
Microloaders 200/pk	Fisher	E5242956003
Nikon A1R Si Confocal Ti series	Nikon	No Catalog number
NIS Elements Software AR3.2 64-bit	Nikon	No Catalog number