التصور التنمية الجمجمة في sox10: Kaede الذي الزرد المعدلة وراثيا عن طريق الخط الوقت الفاصل بين متحد البؤر المجهري
Summary
أصبح التصور من البيانات التجريبية عنصرا أساسيا في تقديم النتائج للمجتمع العلمي. جيل من يعيش تسجيل الوقت الفاصل بين الأجنة المتزايد يساهم في تحسين العرض وفهم العمليات التنموية المعقدة. هذا البروتوكول هو دليل خطوة بخطوة لوضع العلامات الخليوي عبر photoconversion من البروتين Kaede الذي في الزرد.
Abstract
الفقاريات palatogenesis هو عملية التنموية فشلت غاية ومعقدة، والتي تنطوي على الهجرة من قمة العصبية القحفية (CNC) الخلايا، والتقارب والإرشاد من البروز في الوجه، ونضوج الهيكل العظمي القحفي. لدراسة مساهمة قمة العصبية في الجمجمة لمناطق معينة من الحنك الزرد لsox10: تم إنشاء خط Kaede الذي الزرد المعدلة وراثيا. يوفر Sox10 تقييد نسب البروتين مراسل Kaede الذي لقمة العصبية، مما يجعل الخلية وصفها عملية أكثر دقة من الصبغة التقليدية أو الحقن مراسل مرنا. Kaede الذي هو البروتين الذي يحول الصورة للتحويل من الأخضر إلى الأحمر بعد تفعيل الصورة ويجعل من الممكن لمتابعة الخلايا على وجه التحديد. وsox10: Kaede الذي خط المعدلة وراثيا تم استخدامها لإجراء تحليل النسب لتحديد السكان الخلية CNC التي تؤدي إلى الفك العلوي الفك السفلي مقابل عناصر التماثل وتوضيح من البروز الوجه لamniotes. يصف هذا البروتوكول الخطوةق لتوليد يعيش الفيديو في الوقت الفاصل بين لsox10: الجنين الزرد Kaede الذي. وسوف تطور لوحة الغربالي بمثابة مثال عملي. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول لجعل الوقت الفاصل بين متحد البؤر تسجيل أي Kaede الذي أو ما شابه ذلك البروتين مراسل photoconvertible في الزرد المعدلة وراثيا. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن استخدامها لالتقاط التنمية يست طبيعية فقط، ولكن أيضا غير طبيعية من هياكل القحفي في المسوخ الزرد.
Introduction
انشقاقات فموي وجهي تمثل التشوه القحفي الأكثر انتشارا، مع 1/700-1، 000 شحنات تتأثر 1. تعطيل التنمية في وقت مبكر القحفي الجنينية يمكن أن يؤدي إلى تشكيل الشفة المشقوقة والحنك (CL / P). بينما الأسباب لالمشقوقة المتلازمات وقد ثبت إلى حد كبير، أسس جينية وراثية وأشكال nonsyndromic من clefting فموي وجهي لا تزال بحاجة إلى كشف 2-4. من أجل فهم المسببات المرضية وهذه التشوهات، فمن الضروري توضيح تطوير هياكل القحفي على أساس الخلوية.
في جميع أنواع الفقاريات الخلايا العصبية قمة الجمجمة (CNCC) ترحيل من الأنبوب العصبي الظهري لملء الأقواس البلعومية، والتي سوف تسهم في تشكيل هياكل فموي وجهي. تعطيل التنمية في وقت مبكر الجنينية قمة العصبية يمكن أن يؤدي إلى تشكيل تشوهات القحفي بما CL / P 5-7.
في الإعلانdition إلى التشابه الهيكلية بين الزرد والتنمية القحفي الثدييات (CNCCs يقيمون في مناطق متماثلة)، وحفظا للغاية شبكة تنظيمية الجينات. وقد تبين أيضا أن CNCCs تطوير بنفس الطريقة بين الأنواع حيوان سلوي والزرد 8، مما يجعل من الزرد كائن قوية لدراسة الأساس الوراثي للالتنموية وCL / P. لها العديد من المزايا، بما في ذلك حجم صغير وسريع والرحم السابقين التطور الجنيني، ومعدلات التكاثر عالية. وعلاوة على ذلك، فإن الجنين شفافة بصريا، مما يجعلها قابلة للرصد الأحداث التنموية المعقدة تحت المجهر 9. هو نموذج حيواني مثالية لدراسة الهجرة وتمايز الخلايا العصبية قمة الجمجمة.
التوسع في الأعمال المنشورة سابقا 8، 10، 11، ونمط الهجرة من CNCC وصفت بالتفصيل باستخدام sox10: Kaede الذي نموذج المعدلة وراثيا 5. Kaede الذي هو البروتين الصورة القابلة للتحويل التي توRNS من الأخضر إلى الأحمر بعد تفعيل الصورة ويجعل من الممكن تتبع CNCCs على وجه التحديد. خلال هذا التحول هو العمود الفقري المشقوق الببتيد، مما يدل على أن تحويل مستقرة، وهذا يعني يمكن تتبع الخلايا إلى وجهتها النهائية 12. خطوط المعدلة وراثيا المسمى مع Kaede الذي تحت السيطرة النسخي من sox10 أظهرت أن الحنك وحيوان سلوي لوحة الغربالي من الزرد تتشكل homologously بواسطة مزيج من البروز الفك العلوي الثنائي (MXP) مع البروز الجبهي الأنفي (FNP) وأن Y على شكل الانصهار التماس يماثل بين الأنواع.
بين التطبيقات الأخرى، وsox10: تم Kaede الذي نموذج الزرد المعدلة وراثيا المستخدمة لتوليد أشرطة الفيديو من الأجنة الزرد في مراحل تنموية مختلفة لإظهار تشكيل هياكل القحفي العادية وغير العادية. Photoconversion من مجموعات محددة من الخلايا يجعل من الممكن تتبع تطورها. مع هذا الأسلوب نهجا لخلق التصوير الحي تطوير craniofacوقدم الاتحاد العالمي للتعليم في الهياكل الزرد، مما يجعل من السهل لإثبات بصريا هذه العملية التنموية المعقدة.
ويهدف هذا البروتوكول إلى تبادل الخبرات لتوليد هذه المقاطع باستخدام التطور الطبيعي من لوحة الغربالي في sox10: الزرد المعدلة وراثيا Kaede الذي كمثال على ذلك. يمكن كذلك أن يطبق هذا البروتوكول لصنع أشرطة الفيديو الوقت الفاصل بين أي هيكل المستمدة من الخلايا العصبية قمة الجمجمة في الزرد.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا يتم عرض طريقة جديدة لرؤية التنمية القحفي في نموذج الزرد. وsox10: تم Kaede الذي خط الزرد المعدلة وراثيا المستخدمة بنجاح لوصف نمط المهاجرة من CNCC بالتفصيل ما يستخدم كائن نموذج 5.
وقد استخدمت الدراسات السابقة المعالم الإجمالي مث?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفين أشكر روبرت Kelsh لتتكرم تقاسم الزرد sox10 المروج كاشف.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| sox10: kaede transgenic zebrafish line | MGH | Available via the Liao lab | |
| Petri dishes 100×15 mm | BD Falcon | 351029 | |
| Petri dishes 35 mmx10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose | Invitrogen | 15517022 | |
| Lab Tek 2 Chamber SlideSystem | LabTek | 154453 | |
| Microloaders 200/pk | Fisher | E5242956003 | |
| Nikon A1R Si Confocal Ti series | Nikon | No Catalog number | |
| NIS Elements Software AR3.2 64-bit | Nikon | No Catalog number |
References
- . Prevalence at Birth of Cleft Lip With or Without Cleft Palate: Data From the International Perinatal Database of Typical Oral Clefts (IPDTOC). Cleft Palate Craniofac. J. 48 (1), 66-81 (2011).
- Dixon, M. J., et al. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nat. Rev. Genet. 12 (3), 167-178 (2011).
- Mangold, E., Ludwig, K. U., Nothen, M. M. Breakthroughs in the genetics of orofacial clefting. Trends Mol. Med. 17 (12), 725-733 (2011).
- Kimmel, C. B., Miller, C. T., Moens, C. B. Specification and morphogenesis of the zebrafish larval head skeleton. Dev. Biol. 233 (2), 239-257 (2001).
- Dougherty, M., et al. Embryonic Fate Map of First Pharyngeal Arch Structures in the sox10: kaede Zebrafish Transgenic Model. J. Craniofac. Surg. 23 (5), 1333-1337 (2012).
- Trainor, P. A., Krumlauf, R. Hox genes, neural crest cells and branchial arch patterning. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (6), 698-705 (2001).
- Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
- Swartz, M. E., et al. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).
- McCollum, C. W., et al. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth Defects Res. C. Embryo Today. 93 (2), 67-114 (2011).
- Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132 (17), 3977-3988 (2005).
- Eberhart, J. K., et al. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133 (6), 1069-1077 (2006).
- Ando, R., et al. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1993).
- Kawakami, A., et al. The zebrafish-secreted matrix protein you/scube2 is implicated in long-range regulation of hedgehog signaling. Curr. Biol. 15 (5), 480-488 (2005).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell tracking using photoconvertible proteins during zebrafish development. J. Vis. Exp. (67), e4350 (2012).
