Visualisierung von Craniofacial Entwicklung in den sox10: kaede transgener Zebrafische Zeile mit Zeitraffer-konfokale Mikroskopie
Summary
Visualisierung von experimentellen Daten ist zu einem wichtigen Element in Präsentation der Ergebnisse für die wissenschaftliche Gemeinschaft. Generation von Live-Zeitraffer-Aufnahme von wachsenden Embryos trägt zu einer besseren Präsentation und Verständnis für komplexe Entwicklungsprozesse. Dieses Protokoll ist eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Zellmarkierung über der Photo kaede Protein im Zebrafisch.
Abstract
Wirbel palatogenesis ist ein hoch choreographierte und komplexen Entwicklungsprozess, der Migration von Schädel Neuralleiste (CNC)-Zellen, Konvergenz und Erweiterung des Gesichts Protuberanzen und Reifung des kraniofazialen Skeletts beinhaltet. Kaede transgenen Zebrafischlinie generiert wurde: Um den Beitrag der Schädel Neuralleiste auf bestimmte Regionen des Zebrafisches Gaumen sox10 studieren. Sox10-Linie bietet Beschränkung der kaede Reporterprotein zu der Neuralleiste, wodurch die Zellmarkierung eine genauere Verfahren als traditionelle Farbstoff oder Reporter-mRNA-Injektion. Kaede ist ein Foto-Cabrio-Protein, das von grün auf rot schaltet sich nach Foto-Aktivierung und macht es möglich, Zellen genau zu folgen. Die sox10: kaede transgene Linie wurde verwendet, um Abstammung Analyse durchführen, um CNC-Zellpopulationen, die Anlass zu Oberkiefer-Unterkiefer gegenüber Elementen und veranschaulichen Homologie von Gesichts Protuberanzen zu amniotes abzugrenzen. Dieses Protokoll beschreibt den Schritts, eine Live-Zeitraffer-Video eines sox10 generieren: kaede Zebrafischembryo. Entwicklung des Siebbein Platte wird als praktisches Beispiel dienen. Dieses Protokoll kann zur Erstellung einer Zeitraffer-Aufnahme eines konfokalen kaede oder ähnliche photoconvertible Reporterprotein in transgenen Zebrafisch angewendet werden. Weiterhin kann es verwendet werden, um nicht nur normal, sondern auch abnorme Entwicklung der kraniofazialen Strukturen in den Zebrafisch-Mutanten zu erfassen.
Introduction
Gesichtsspalten stellen die häufigsten kraniofazialen Fehlbildungen, mit 1/700-1, 000 betroffenen Lieferungen ein. Störung der frühen embryonalen kraniofazialen Entwicklung kann zur Bildung von Lippen-Kiefer-Gaumen-(CL / P) führen. Während Ursachen für syndromale Spalt weitgehend gezeigt wurde, müssen die genetischen und epigenetischen Grundlagen der nicht-syndromale Formen der orofazialen Spaltbildung noch aufgedeckt 2-4 werden. Um die Ätiologie und Pathogenese dieser Fehlbildungen zu verstehen, ist es notwendig, die Entwicklung der kraniofazialen Strukturen auf zellulärer Basis aufzuklären.
In allen Wirbeltierarten Schädel Neuralleistenzellen (CNCC) wandern aus dem dorsalen Neuralrohr, die Kiemenbögen, die zur Bildung von orofazialen Strukturen beitragen füllen. Störung der frühen embryonalen Neuralleiste Entwicklung ist auf die Bildung von Gesichtsschädelfehlbildungen einschließlich CL / P 5-7 führen.
In Ad-dition, strukturelle Ähnlichkeiten zwischen Zebrafisch-und Säugetier kraniofazialen Entwicklung (CNCCs befinden sich in homologen Regionen) wird das Gen regulatorische Netzwerk hoch konserviert. Es wurde auch gezeigt, dass CNCCs entwickeln in der gleichen Weise zwischen amniote Arten und Zebrafisch 8, so dass das Zebrafisch eine leistungsfähige Organismus für das Studium der Entwicklungs-und genetischen Grundlagen von CL / P. Es hat viele Vorteile, wie geringe Größe, schnelle und Ex-utero embryonalen Entwicklung und hohe Zuchtraten. Darüber hinaus ist der Embryo optisch transparent, so dass es für die Beobachtung von komplexen Entwicklungsschritte unter dem Mikroskop 9. Es ist ein ideales Tiermodell für die Untersuchung von Migration und Differenzierung von Hirn Neuralleistenzellen.
Kaede transgenen Modell 5: Aufbauend auf zuvor veröffentlichte Arbeit 8, 10, 11, die Migrationsmuster der CNCC wurde ausführlich über die sox10 beschrieben. Kaede ist ein Foto-Cabrio-Protein, das turns von grün auf rot nach Foto-Aktivierung und macht es möglich, CNCCs genau verfolgen. Während dieser Umwandlung das Peptidrückgrat gespalten, was darauf hindeutet, dass die Umwandlung ist stabil, was bedeutet, können die Zellen an ihren endgültigen Bestimmungsort 12 verfolgt werden. Transgene Linien mit kaede unter der Transkriptionskontrolle sox10 beschriftet zeigte, dass die amniote Gaumen und das Siebbein Platte des Zebrafisch sind homolog durch Fusion von bilateralen Kiefer Protuberanzen (MXP) mit der Prominenz frontonasalen (FNP) gebildet wird und dass das Y-förmige Naht ist analog Fusion zwischen Arten.
Unter anderen Anwendungen, die sox10: kaede transgenen Zebrafisch-Modell wurde verwendet, um Videos von Zebrafisch-Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien zu erzeugen, um die Bildung von normalen und abnormalen kraniofazialen Strukturen zeigen. Photo bestimmter Gruppen von Zellen ist es möglich, ihre Entwicklung zu verfolgen. Mit dieser Methode ein Ansatz, um die Live-Darstellung der Entwicklung craniofac erstellenial Strukturen im Zebrafisch eingeführt wird, macht es einfach, dieses komplexe Entwicklungsprozess visuell demonstrieren.
Kaede transgenen Zebrafisch als Beispiel: Dieses Protokoll wird auf die gemeinsame Nutzung der Erfahrungen der Erzeugung diese Videos mit der normalen Entwicklung des Siebbein Platte in Sox10 ab. Dieses Protokoll kann weiter zu machen Zeitraffer-Videos von jeder Struktur von Hirn Neuralleistenzellen in Zebrafisch-Regelung angewendet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wird ein neues Verfahren zur Darstellung von kraniofazialen Entwicklung im Zebrafischmodell dargestellt. Die sox10: kaede transgenen Zebrafischlinie wurde erfolgreich verwendet, um die Migrationsmuster der CNCC im Detail zu beschreiben ist als Modellorganismus 5 verwendet.
Frühere Studien haben Brutto Sehenswürdigkeiten wie das Auge verwendet werden, um die Zielzellen und haben sich auf kaede mRNA Injektion, Photo Assays oder Käfig Fluorescein Dextran für Photo 10, 1…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken für die freundliche Robert Kelsh teilen die Zebrafisch-Promotor sox10 Reagenz.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| sox10: kaede transgenic zebrafish line | MGH | Available via the Liao lab | |
| Petri dishes 100×15 mm | BD Falcon | 351029 | |
| Petri dishes 35 mmx10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose | Invitrogen | 15517022 | |
| Lab Tek 2 Chamber SlideSystem | LabTek | 154453 | |
| Microloaders 200/pk | Fisher | E5242956003 | |
| Nikon A1R Si Confocal Ti series | Nikon | No Catalog number | |
| NIS Elements Software AR3.2 64-bit | Nikon | No Catalog number |
References
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