Sox10 में Craniofacial विकास के दृश्य: Kaede ट्रांसजेनिक Zebrafish रेखा समय चूक confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग
Summary
प्रयोगात्मक डेटा के दृश्य के वैज्ञानिक समुदाय के लिए परिणाम पेश करने में एक प्रमुख तत्व बन गया है. बढ़ रहा भ्रूण का जीना समय चूक रिकॉर्डिंग की पीढ़ी जटिल विकास की प्रक्रिया की बेहतर प्रस्तुति और समझ के लिए योगदान देता है. इस प्रोटोकॉल zebrafish में Kaede प्रोटीन की photoconversion के माध्यम से सेल लेबलिंग के लिए एक कदम दर कदम गाइड है.
Abstract
हड्डीवाला palatogenesis कपाल तंत्रिका शिखा (सीएनसी) कोशिकाओं, अभिसरण और चेहरे prominences का विस्तार, और craniofacial कंकाल की परिपक्वता के प्रवास शामिल है जो एक अत्यधिक नृत्य और जटिल विकास की प्रक्रिया है. Kaede ट्रांसजेनिक zebrafish लाइन उत्पन्न किया गया था: zebrafish तालू के विशिष्ट क्षेत्रों में एक sox10 को कपाल तंत्रिका शिखा के योगदान का अध्ययन करने के लिए. Sox10 जिससे परंपरागत डाई या रिपोर्टर mRNA इंजेक्शन की तुलना में एक अधिक सटीक प्रक्रिया लेबलिंग सेल बनाने, तंत्रिका शिखा को Kaede संवाददाता प्रोटीन की वंश प्रतिबंध प्रदान करता है. Kaede फोटो एक्टिवेशन के बाद हरे से लाल करने के लिए बदल जाता है और यह संभव ठीक कोशिकाओं का पालन करने के लिए बनाता है एक फोटो परिवर्तनीय प्रोटीन होता है. sox10: Kaede ट्रांसजेनिक लाइन जबड़े तत्वों बनाम दाढ़ की हड्डी को जन्म दे और अम्निओट जीवों को चेहरे prominences की अनुरूपता वर्णन है कि सीएनसी सेल आबादी को चित्रित करने के लिए वंश विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इस प्रोटोकॉल कदम का वर्णनKaede zebrafish भ्रूण: एक sox10 का जीना समय चूक वीडियो उत्पन्न करने के लिए है. सलाखें प्लेट का विकास एक व्यावहारिक उदाहरण के रूप में काम करेगा. इस प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक zebrafish में किसी भी Kaede या इसी तरह photoconvertible संवाददाता प्रोटीन का एक समय चूक confocal रिकॉर्डिंग बनाने के लिए लागू किया जा सकता है. इसके अलावा, यह zebrafish म्यूटेंट में craniofacial संरचनाओं के सामान्य ही है, लेकिन यह भी असामान्य नहीं विकास पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
Orofacial clefts 1/700-1 साथ, सबसे अधिक प्रचलित craniofacial विकृति का प्रतिनिधित्व करते हैं, 000 प्रसव 1 को प्रभावित किया. जल्दी embryological craniofacial विकास के विघटन फांक होंठ और तालु (सीएल / पी) के गठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. सहलाक्षणिक फांक के लिए कारणों में मोटे तौर पर दिखाया गया है, वहीं orofacial clefting की nonsyndromic रूपों के आनुवंशिक और epigenetic ठिकानों अभी भी 2-4 पर्दाफाश करने की आवश्यकता है. इन विकृतियों के एटियलजि और रोगजनन समझने के क्रम में, यह एक सेलुलर आधार पर craniofacial संरचनाओं के विकास को स्पष्ट करने के लिए आवश्यक है.
सभी हड्डीवाला प्रजातियों में कपाल तंत्रिका शिखा कोशिकाओं (CNCC) orofacial संरचनाओं के गठन के लिए योगदान देगा जो ग्रसनी मेहराब, आबाद करने के लिए पृष्ठीय न्यूरल ट्यूब से विस्थापित. जल्दी embryological तंत्रिका शिखा विकास के विघटन सीएल / पी 5-7 सहित craniofacial विरूपताओं के गठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
विज्ञापन मेंzebrafish और स्तनधारी craniofacial विकास (CNCCs मुताबिक़ क्षेत्रों में रहते हैं) के बीच संरचनात्मक समानता के प्रत्यर्पण, जीन विनियामक नेटवर्क अत्यधिक संरक्षित है. यह भी CNCCs zebrafish सीएल / पी. के विकास और आनुवंशिक आधार के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली जीव बनाने, amniote प्रजातियों और zebrafish 8 के बीच एक ही फैशन में विकसित दिखाया गया है कि यह छोटे आकार, तेजी से और पूर्व utero भ्रूण के विकास, और उच्च प्रजनन दर सहित कई फायदे हैं. इसके अलावा, भ्रूण माइक्रोस्कोप 9 के तहत जटिल विकासात्मक घटनाओं का अवलोकन करने के लिए यह उत्तरदायी बनाने, ऑप्टिकली पारदर्शी है. यह प्रवास और कपाल तंत्रिका शिखा कोशिकाओं की भिन्नता के अध्ययन के लिए एक आदर्श पशु मॉडल है.
Kaede ट्रांसजेनिक मॉडल 5: पहले प्रकाशित काम 8, 10, 11, CNCC के प्रवासी पैटर्न पर विस्तार sox10 का उपयोग कर विस्तार से वर्णित किया गया था. Kaede एक फोटो परिवर्तनीय प्रोटीन है कि टीयूफोटो एक्टिवेशन के बाद लाल हरे से RNS और यह संभव ठीक CNCCs का पता लगाने के लिए बनाता है. इस परिवर्तन के दौरान पेप्टाइड रीढ़ रूपांतरण कोशिकाओं को उनके अंतिम गंतव्य से 12 लगाया जा सकता है, जिसका अर्थ है स्थिर है, सुझाव है कि cleaved है. Sox10 के transcriptional नियंत्रण में Kaede के साथ लेबल ट्रांसजेनिक लाइनों amniote तालू और zebrafish की सलाखें प्लेट वाई आकार संलयन सीवन के बीच अनुरूप है ललाटनासास्थिक प्रमुखता (FNP) के साथ और कहा कि द्विपक्षीय दाढ़ prominences (MXP) के विलय से homologously गठन कर रहे हैं कि पता चला प्रजातियों.
अन्य अनुप्रयोगों के अलावा, sox10: Kaede ट्रांसजेनिक zebrafish मॉडल सामान्य और असामान्य craniofacial संरचनाओं के गठन को दिखाने के लिए विभिन्न विकासात्मक चरणों में zebrafish भ्रूण की वीडियो उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. कोशिकाओं के विशिष्ट समूहों के photoconversion यह संभव उनके विकास को ट्रैक करने के लिए बनाता है. Craniofac के विकास के रहते इमेजिंग बनाने के लिए इस विधि का एक दृष्टिकोण के साथzebrafish में ial संरचनाओं यह आसान नेत्रहीन इस जटिल विकास की प्रक्रिया का प्रदर्शन करने के लिए कर रही है, शुरू की है.
एक उदाहरण के रूप में Kaede ट्रांसजेनिक zebrafish: इस प्रोटोकॉल sox10 में सलाखें थाली के सामान्य विकास का उपयोग कर इन वीडियो पैदा करने का अनुभव साझा करने के उद्देश्य से है. इस प्रोटोकॉल आगे zebrafish में कपाल तंत्रिका शिखा कोशिकाओं से व्युत्पन्न किसी भी संरचना का समय चूक वीडियो बनाने के लिए लागू किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ zebrafish मॉडल में craniofacial विकास के दृश्य के लिए एक नई विधि दिखाया गया है. sox10: Kaede ट्रांसजेनिक zebrafish लाइन सफलतापूर्वक विस्तार से CNCC के प्रवासी पैटर्न का वर्णन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है एक मॉडल जीव 5 के ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों कृपया zebrafish sox10 प्रमोटर अभिकर्मक साझा करने के लिए रॉबर्ट Kelsh धन्यवाद.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| sox10: kaede transgenic zebrafish line | MGH | Available via the Liao lab | |
| Petri dishes 100×15 mm | BD Falcon | 351029 | |
| Petri dishes 35 mmx10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose | Invitrogen | 15517022 | |
| Lab Tek 2 Chamber SlideSystem | LabTek | 154453 | |
| Microloaders 200/pk | Fisher | E5242956003 | |
| Nikon A1R Si Confocal Ti series | Nikon | No Catalog number | |
| NIS Elements Software AR3.2 64-bit | Nikon | No Catalog number |
References
- . Prevalence at Birth of Cleft Lip With or Without Cleft Palate: Data From the International Perinatal Database of Typical Oral Clefts (IPDTOC). Cleft Palate Craniofac. J. 48 (1), 66-81 (2011).
- Dixon, M. J., et al. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nat. Rev. Genet. 12 (3), 167-178 (2011).
- Mangold, E., Ludwig, K. U., Nothen, M. M. Breakthroughs in the genetics of orofacial clefting. Trends Mol. Med. 17 (12), 725-733 (2011).
- Kimmel, C. B., Miller, C. T., Moens, C. B. Specification and morphogenesis of the zebrafish larval head skeleton. Dev. Biol. 233 (2), 239-257 (2001).
- Dougherty, M., et al. Embryonic Fate Map of First Pharyngeal Arch Structures in the sox10: kaede Zebrafish Transgenic Model. J. Craniofac. Surg. 23 (5), 1333-1337 (2012).
- Trainor, P. A., Krumlauf, R. Hox genes, neural crest cells and branchial arch patterning. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (6), 698-705 (2001).
- Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
- Swartz, M. E., et al. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).
- McCollum, C. W., et al. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth Defects Res. C. Embryo Today. 93 (2), 67-114 (2011).
- Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132 (17), 3977-3988 (2005).
- Eberhart, J. K., et al. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133 (6), 1069-1077 (2006).
- Ando, R., et al. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1993).
- Kawakami, A., et al. The zebrafish-secreted matrix protein you/scube2 is implicated in long-range regulation of hedgehog signaling. Curr. Biol. 15 (5), 480-488 (2005).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell tracking using photoconvertible proteins during zebrafish development. J. Vis. Exp. (67), e4350 (2012).
