SOX10中の顔面の開発の可視化：楓トランスジェニックゼブラフィッシュラインタイムラプス共焦点顕微鏡を用いて
Summary
実験データの可視化は、科学界に結果を提示する重要な要素となっています。成長した胚のライブタイムラプス撮影の生成は複雑な発達過程をより良くプレゼンテーションや理解に貢献しています。このプロトコルは、ゼブラフィッシュで楓タンパク質の光変換を経由して細胞標識へのステップバイステップガイドです。
Abstract
脊椎動物palatogenesisは頭蓋神経堤（CNC）細胞、収束と顔のプロミネンスの延長、および頭蓋顔面骨格の成熟の移行を伴う非常に振り付けで複雑な発達過程です。楓トランスジェニックゼブラフィッシュラインが生成されました：ゼブラフィッシュ口蓋の特定の領域SOX10に頭蓋神経堤の寄与を研究すること。 SOX10は、それによって、伝統的な染料やレポーターmRNAの注入よりもより正確なプロセスを標識し、細胞を作り、神経堤に楓のレポータータンパク質の系統限定を提供しています。楓、光活性化の後に赤色から緑色に変わり、正確に細胞を追跡することができる光転換タンパク質である。 SOX10：楓トランスジェニック系統は、下顎要素対上顎を生じさせると、羊膜に顔面プロミネンスの相同性を示してCNC細胞集団を線引きする系統分析を実行するために使用した。このプロトコルは、手順を説明します楓ゼブラフィッシュ胚：SOX10のライブの時間経過のビデオを生成するために、S。篩骨プレートの開発は、実用的な例となる。このプロトコルは、トランスジェニックゼブラフィッシュのどの楓または類似photoconvertibleレポータータンパク質のタイムラプス共焦点記録を作るに適用することができます。さらに、ゼブラフィッシュ変異体における頭蓋顔面構造のみならず、正常でなく、発達異常を捕捉するために使用することができる。
Introduction
口腔顔面裂が1/700-1で、最も一般的な頭蓋顔面奇形を表し、000配達は1に影響を与えた。初期の発生学的頭蓋顔面の開発の破壊は、口唇口蓋裂（CL / P）の形成につながることができます。症候裂の原因は、主に示してきたが、口腔顔面分裂文形成の非症候性形態の遺伝的およびエピジェネティックな拠点は、まだ2-4を発見する必要があります。これらの奇形の病因および発症機序を理解するためには、セルラーベースで頭蓋顔面構造の発達を解明する必要がある。
すべての脊椎動物種に頭蓋神経堤細胞（CNCC）口腔顔面構造の形成に寄与する咽頭のアーチを、設定するために、背側神経管から移行。初期の発生学的神経堤の開発の破壊は、CL / P 5-7を含む頭蓋顔面奇形の形成につながることができます。
ADでゼブラフィッシュおよび哺乳動物の頭蓋顔面の開発（CNCCsは相同領域に存在する）との間の構造的類似性ditionは、遺伝子制御ネットワークが高度に保存されている。またCNCCsは、ゼブラフィッシュのCL / Pの発生および遺伝的基礎を研究するための強力な生物を作り、羊膜種およびゼブラフィッシュ8の間に同じ様式で発症することが示されているそれは、小型、高速かつ元子宮胚発生、高い繁殖率を含む多くの利点を持っています。さらに、胚を顕微鏡9の下に複雑な発生事象を観察することが影響を受けやすいこと、光学的に透明である。これは、頭蓋神経堤細胞の遊走および分化の研究のための理想的な動物モデルである。
楓トランスジェニックモデル5：以前に公開され仕事8、10、11に拡大して、CNCCの遊走パターンは、SOX10を用いて詳細に説明した。楓はTUフォト転換タンパク質である光活性化後の緑色から赤色へのRNSかつ正確CNCCsをトレースすることができる。この変換の間、ペプチド骨格は、細胞がそれらの最終目的地12まで追跡することができることを意味し、変換が安定であることを示唆して切断される。 SOX10の転写制御下に楓で標識したトランスジェニック系統は、羊膜の口蓋とゼブラフィッシュの篩骨板は前頭鼻隆起（FNP）であり、Y字型融合縫い目の間に類似であることを、二国間上顎プロミネンス（MXP）の融合によって相同的に形成されることを示した種。
他の用途の中でも、SOX10：楓トランスジェニックゼブラフィッシュモデルは、正常および異常な頭蓋顔面構造の形成を示すために、異なる発達段階でのゼブラフィッシュ胚のビデオを生成するために使用された。細胞の特定の基の光変換は、それらの発達を追跡することが可能となる。 craniofacを開発するライブイメージングを作成するには、この方法でアプローチしてゼブラフィッシュにおけるIAL構造は、それが簡単に視覚的に、この複雑な発達過程を実証すること、導入される。
例として楓トランスジェニックゼブラ：このプロトコルはSOX10内篩骨プレートの正常な発達を使用してこれらのビデオを生成する経験を共有することを目的としている。このプロトコルは、さらに、ゼブラフィッシュにおける頭蓋神経堤細胞に由来する任意の構造の経時ビデオを作るにも適用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここゼブラフィッシュモデルにおける頭蓋顔面の開発の可視化のための新たな方法が示されている。 SOX10：楓トランスジェニックゼブラフィッシュ線が正常に詳細にCNCCの移動パターンを記述するために使用されてきたが、モデル生物5として使用される。
以前の研究では、細胞を標的とする眼などのグロスランドマークを使用していると楓mRNAの注入、光変換アッ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、親切にゼブラフィッシュSOX10プロモーター試薬を共有するためのロバートKelshに感謝します。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| sox10: kaede transgenic zebrafish line | MGH | Available via the Liao lab | |
| Petri dishes 100×15 mm | BD Falcon | 351029 | |
| Petri dishes 35 mmx10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose | Invitrogen | 15517022 | |
| Lab Tek 2 Chamber SlideSystem | LabTek | 154453 | |
| Microloaders 200/pk | Fisher | E5242956003 | |
| Nikon A1R Si Confocal Ti series | Nikon | No Catalog number | |
| NIS Elements Software AR3.2 64-bit | Nikon | No Catalog number |
References
- . Prevalence at Birth of Cleft Lip With or Without Cleft Palate: Data From the International Perinatal Database of Typical Oral Clefts (IPDTOC). Cleft Palate Craniofac. J. 48 (1), 66-81 (2011).
- Dixon, M. J., et al. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nat. Rev. Genet. 12 (3), 167-178 (2011).
- Mangold, E., Ludwig, K. U., Nothen, M. M. Breakthroughs in the genetics of orofacial clefting. Trends Mol. Med. 17 (12), 725-733 (2011).
- Kimmel, C. B., Miller, C. T., Moens, C. B. Specification and morphogenesis of the zebrafish larval head skeleton. Dev. Biol. 233 (2), 239-257 (2001).
- Dougherty, M., et al. Embryonic Fate Map of First Pharyngeal Arch Structures in the sox10: kaede Zebrafish Transgenic Model. J. Craniofac. Surg. 23 (5), 1333-1337 (2012).
- Trainor, P. A., Krumlauf, R. Hox genes, neural crest cells and branchial arch patterning. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (6), 698-705 (2001).
- Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
- Swartz, M. E., et al. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).
- McCollum, C. W., et al. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth Defects Res. C. Embryo Today. 93 (2), 67-114 (2011).
- Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132 (17), 3977-3988 (2005).
- Eberhart, J. K., et al. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133 (6), 1069-1077 (2006).
- Ando, R., et al. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1993).
- Kawakami, A., et al. The zebrafish-secreted matrix protein you/scube2 is implicated in long-range regulation of hedgehog signaling. Curr. Biol. 15 (5), 480-488 (2005).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell tracking using photoconvertible proteins during zebrafish development. J. Vis. Exp. (67), e4350 (2012).
