सीए की भूमिका का आकलन के लिए इमेजिंग परख लाइव<sup> 2 +</supताकना के गठन विष घावों की मरम्मत में> और Sphingomyelinase
Summary
Lipophilic डाई FM1-43 के संपर्क में कोशिकाओं की लाइव इमेजिंग ताकना के गठन विषाक्त पदार्थों प्लाज्मा झिल्ली से हटा रहे हैं जिसके द्वारा कैनेटीक्स का सटीक निर्धारण की अनुमति देता. इस CA के लिए आवश्यकताओं 2 +, sphingomyelinase और प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत पर अन्य कारकों का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक संवेदनशील परख है.
Abstract
प्लाज्मा झिल्ली चोट एक लगातार घटना है, और घाव तेजी से सेलुलर अस्तित्व को सुनिश्चित करने की मरम्मत किया जाना है. सीए 2 + की आमद 30 सेकंड ~ भीतर प्लाज्मा झिल्ली पर यांत्रिक घाव की मरम्मत हो सके कि एक महत्वपूर्ण संकेत घटना है. हाल के अध्ययनों स्तनधारी कोशिकाओं को भी ध्यान में लीन होना ताकना endocytosis द्वारा पीछा lysosomal एंजाइम एसिड sphingomyelinase की एक्सोसाइटोसिस शामिल है कि एक सीए 2 + निर्भर प्रक्रिया में विषाक्त पदार्थों के गठन के साथ permeabilization के बाद उनकी प्लाज्मा झिल्ली reseal कि पता चला. यहाँ, हम विष streptolysin हे द्वारा permeabilized कोशिकाओं की resealing सीए 2 + आमद पर भी तेजी और निर्भर है कि प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया पद्धति का वर्णन. परख डिजाइन की अनुमति देता चोट घटना के तुल्यकालन और इमेजिंग द्वारा प्लाज्मा झिल्ली अखंडता को बहाल करने और liphophilic डाई FM1-43 intracellular झिल्ली पहुंचता है जिसके द्वारा हद बढ़ाता कोशिकाओं की क्षमता का एक सटीक गतिज माप. इस लाइव परख ए एल एसओ exogenously की क्षमता का एक संवेदनशील आकलन उनके प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत के लिए कोशिकाओं की क्षमता को दर्शाती है, FM1-43 बाढ़ को बाधित करने के लिए इस तरह के sphingomyelinase के रूप में घुलनशील कारकों गयी अनुमति देता है. यह परख हमें एंजाइम की बाह्य अलावा सीए 2 + के अभाव में permeabilized कोशिकाओं की resealing को बढ़ावा देता है के बाद से sphingomyelinase, सीए 2 + निर्भर एक्सोसाइटोसिस के बहाव में कार्य करता है कि पहली बार के लिए दिखाने के लिए अनुमति दी.
Introduction
यह यांत्रिक चोट के बाद प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत एक सीए 2 + निर्भर प्रक्रिया 1,2 है कि कई दशकों के लिए जाना जाता रहा है. बाद में पढ़ाई घाव के माध्यम से सीए 2 + बाढ़ 3,4 resealing के लिए आवश्यक है, जो चोट के स्थल पर intracellular vesicles के एक्सोसाइटोसिस की एक जोरदार प्रक्रिया आरंभ करने वाली दिखाया. कोशिकाओं के cytoplasm में भरी हुई एक फ्लोरोसेंट रंजक के नुकसान की दर मरम्मत की गति का आकलन किया, और resealing चोट 5 के बाद <30 सेकंड के भीतर पूरा कर लिया गया है कि निष्कर्ष निकाला गया था. दो मॉडल शुरू में प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत में एक्सोसाइटोसिस के लिए आवश्यकता समझाने के लिए प्रस्तावित किया गया: घाव के माध्यम से सीए 2 + बाढ़ एक बड़ी "पैच" के गठन, intracellular vesicles के शुरू में homotypic संलयन हो सके कि जो सुझाव दिया है 1) "पैच" मॉडल, कि होगा फिर घाव 6 और कहा कि झिल्ली मिलाइए प्रस्तावित जो 2) तनाव में कमी मॉडल, reseal करने के प्लाज्मा झिल्ली को लागू किया जाघाव के आसपास के क्षेत्र में सीए 2 + निर्भर एक्सोसाइटोसिस द्वारा घ. bilayer 7 के resealing की सुविधा, प्लाज्मा झिल्ली तनाव को कम करेगा. प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत में सीए 2 + ट्रिगर एक्सोसाइटोसिस की भूमिका आगे लाइसोसोम घायल कोशिकाओं में उनके एक्सोसाइटोसिस और प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत की सुविधा है, जो एक सीए 2 + सेंसर अणु, synaptotagmin सातवीं होते दिखा रहा है कि अध्ययन के द्वारा बढ़ाया गया था 8,9,10,11 .
हालांकि, अतिरिक्त सबूत अकेले एक्सोसाइटोसिस प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत को बढ़ावा देने के लिए पर्याप्त नहीं था कि संकेत दिया है. प्लाज्मा झिल्ली पर यांत्रिक आँसू के अलावा, सेल चोट के एक लगातार फॉर्म बैक्टीरिया 12,13 या प्रतिरक्षा कोशिकाओं 14,15 द्वारा उत्पादित ताकना के गठन विषाक्त पदार्थों से permeabilization है. यांत्रिक आँसू के विपरीत, ताकना गठन प्रोटीन प्लाज्मा झिल्ली एक झिल्ली "पैच" लगाने से या reduc द्वारा बस resealed नहीं किया जा सकता कि एक स्थिर, प्रोटीन लाइन ताकना बनाने पर खुद को डालनेझिल्ली तनाव आईएनजी. दिलचस्प, पढ़ाई स्तनधारी कोशिकाओं ताकना गठन प्रोटीन के साथ permeabilization के बाद उनकी प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत के लिए एक कुशल व्यवस्था है, और इस प्रक्रिया को भी बाह्य सीए 2 + 12 की उपस्थिति की आवश्यकता है कि पता चला. यांत्रिक घाव 5 के साथ मनाया के रूप में यह निष्कर्ष कोशिका की सतह से transmembrane ताकना हटाने की भी एक तेजी से प्रक्रिया था का सवाल उठाया. प्रक्रिया सीए 2 + कोशिकी की आवश्यकता है, और 30 सेकंड ~ के भीतर पूरा हो गया है: हैरानी की बात है, हमारे हाल के अध्ययनों से ताकना के गठन विषाक्त पदार्थों के साथ permeabilized कोशिकाओं की resealing यांत्रिक घाव की मरम्मत करने के लिए बहुत समान गुण है कि पता चला. अधिक विस्तार से इस प्रक्रिया की जांच कर रही है, हम हाल ही में लाइसोसोम के सीए 2 + विनियमित एक्सोसाइटोसिस के अलावा, प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत एसिड sphingomyelinase (एएसएम) एंजाइम lysosomal की रिहाई से चालू होने और आवश्यक है, जो endocytosis की एक तेजी से फार्म, शामिल है कि सीखा न केवल वीं के लिएtransmembrane pores के ई हटाने, लेकिन यह भी यांत्रिक घाव 16 की मरम्मत के लिए.
ताकना गठन प्रोटीन के साथ permeabilization के बाद सेल resealing के कैनेटीक्स का निर्धारण करने के लिए, हमारी प्रयोगशाला में हम लेजर घायल पृथक मांसपेशी फाइबर की 17 resealing का आकलन करने के लिए पहले से इस्तेमाल किया गया था कि एक लाइव इमेजिंग पद्धति को रूपांतरित किया. यह परख stably प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि हो रही लिपिड bilayers के बाहरी पत्रक में intercalates जो lipophilic डाई FM1-43, के गुणों पर निर्भर करता है. प्लाज्मा झिल्ली bilayer प्लाज्मा झिल्ली चोट का पता लगाने और 18,16,19,20 की मरम्मत के लिए एक संवेदनशील परख प्रदान करने, intracellular झिल्ली को बाह्य डाई लाभ का उपयोग बाधित है. ताकना गठन प्रोटीन के साथ permeabilization के बाद सेल resealing के आकलन के लिए इस परख अनुकूलन करने के लिए, हम झिल्ली कोलेस्ट्रॉल 21 को बांधता है, जो जीवाणु विष streptolysin हे (SLO), के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं पूर्व incubated. तुल्यकालिक सेलpermeabilization तो आसानी से ताकना गठन transmembrane की ओर जाता है कि रचना में oligomerization और बदलाव को सक्रिय करता है जो एक गर्म खुर्दबीन मंच, मध्यम गर्म करने के लिए बर्फ से कोशिकाओं को ले जाकर प्राप्त किया जा सकता है. इस दृष्टिकोण का एक लाभ यह लेजर लोग घायल हो गए का उपयोग पहले प्रकाशित assays से अधिक, कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या सेल की आबादी का बेहतर नमूना उपलब्ध कराने, एक सूक्ष्म क्षेत्र में एक साथ विश्लेषण किया जा सकता है. ताकना के गठन विषाक्त पदार्थों के साथ यांत्रिक चोट और permeabilization के बाद देखा सेल resealing प्रक्रिया के बीच यंत्रवत समानता को देखते हुए, हम यहाँ वर्णन परख प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत की मौलिक प्रक्रिया में शामिल घटकों विदारक के लिए एक बहुत बहुमुखी और शक्तिशाली तरीका प्रदान करता है. एक उदाहरण के रूप में, हम यह सुधार प्रक्रिया के सीए 2 + निर्भर और स्वतंत्र चरणों की पहचान करने के लिए इस परख का उपयोग संभव है कि दिखा.
Protocol
Representative Results
Discussion
यांत्रिक चोट और प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत पर पहले के अध्ययनों कांच के मोती, micropipetting, बाल काटना, scratching या scraping छोड़ने से लेकर, घायल कोशिकाओं के विभिन्न तंत्र पर भरोसा किया. इन सभी assays के readout के बजाय मात्रात्मक से …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम हम SLO प्लाज्मिड अभिव्यक्ति के लिए ओकलाहोमा के विश्वविद्यालय से डॉ. आर Tweten धन्यवाद NWA के लिए एनआईएच अनुदान R37 AI34867 और R01 GM064625 द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Reagent | |||
| HeLa 229 cell line | ATCC | CCL2-1 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | 11965 | |
| DMEM High Glucose No Calcium | Invitrogen | 20168 | |
| FM1-43 | Invitrogen | T3163 | |
| Optimem Reduced Serum | Invitrogen | 31985 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778 | |
| Control medium GC content RNAi oligo | Invitrogen | 12935300 | |
| SMPD1 RNAi oligo | Invitrogen | HSS143988 | |
| Fetal Bovine Serum Heat-inactivated | Gemini-Bioproducts | 100-106 | |
| Sphingomyelinase from Bacillus cereus | Sigma | S7651 | |
| 35 mm-glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-14 | |
| Material | |||
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Camera | Hamamatsu Photonics | C9100-50 | |
| Spinning disk confocal microscope | PerkinElmer | UltraViewVoX | |
| Software analysis software | PerkinElmer | Volocity Suite | |
| Environmental chamber | Pathology Devices | LiveCell System Chamber |
References
- Heilbrunn, L. . The dynamics of living protoplasm. , (1956).
- Chambers, R., Chambers, E. . Explorations into the nature of the living cell. , (1961).
- Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. J. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).
- Miyake, K., McNeil, P. L. Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption. J. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).
- Steinhardt, R. A., Guoqiang, B., Alderton, J. M. Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release. Science. 263, 390-393 (1994).
- McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. J. Cell Sci. 113, 1891-1902 (2000).
- Togo, T., Alderton, J. M., Bi, G. Q., Steinhardt, R. A. The mechanism of facilitated cell membrane resealing. J. Cell Sci. 112, 719-731 (1999).
- Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. J. Cell Biol. 137, 93-104 (1997).
- Reddy, A., Caler, E., Andrews, N. Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. J. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).
- Chakrabarti, S., et al. Impaired membrane resealing and autoimmune myositis in synaptotagmin VII-deficient mice. J. Cell Biol. 162, 543-549 (2003).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).
- Iacovache, I., van der Goot, F. G., Pernot, L. Pore formation: an ancient yet complex form of attack. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1611-1623 (2008).
- Morgan, B. P., Campbell, A. K. The recovery of human polymorphonuclear leucocytes from sublytic complement attack is mediated by changes in intracellular free calcium. Biochem. J. 231, 205-208 (1985).
- Keefe, D., et al. Perforin triggers a plasma membrane-repair response that facilitates CTL induction of apoptosis. Immunity. 23, 249-262 (2005).
- Idone, V., et al. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. J. Cell Biol. 180, 905-914 (2008).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).
- Tam, C., et al. Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair. J. Cell Biol. 189, 1027-1038 (2010).
- Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. J. Vis. Exp. (52), e2717 (2011).
- Tweten, R. K. Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins. Infect. Immun. 73, 6199-6209 (2005).
- Zha, X., et al. Sphingomyelinase treatment induces ATP-independent endocytosis. J. Cell Biol. 140, 39-47 (1998).
- Buckley, J. T. Crossing three membranes. Channel formation by aerolysin. FEBS Lett. 307, 30-33 (1992).
- Parker, M. W., et al. Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-channel states. Nature. 367, 292-295 .
- Yamaji-Hasegawa, A., et al. Oligomerization and pore formation of a sphingomyelin-specific toxin, lysenin. J. Biol. Chem. 278, 22762-22770 (2003).
