Wonen Imaging Assay voor het beoordelen van de Rollen van Ca^{2 +} En sphingomyelinase in de Reparatie van Pore-vormende Toxine Wonden

Summary

Beeldvorming van levende cellen blootgesteld aan de lipofiele kleurstof FM1-43 maakt nauwkeurige bepaling van de kinetiek waarmee poriënvormende toxines worden verwijderd uit de plasmamembraan. Dit is een gevoelige test die kan worden gebruikt om vereisten voor Ca ^{2 +,} sphingomyelinase en andere factoren plasmamembraan reparatie beoordelen.

Abstract

Plasmamembraan letsel is een frequente gebeurtenis en wonden snel worden gerepareerd cellulaire overleven. Instroom van ^{Ca2 +} is een belangrijke signalerende gebeurtenis die de reparatie van mechanische wonden veroorzaakt op het plasmamembraan binnen ~ 30 sec. Recente studies toonden aan dat zoogdiercellen hun plasmamembraan sluit ook na permeabilisatie met porievormende toxinen in een ^{Ca2 +-afhankelijk} proces dat exocytose van het lysosomale enzym zure sphingomyelinase gevolgd door endocytose poriën omvat. Hier beschrijven we het gebruik aan te tonen dat het opnieuw afdichten van de cellen permeabel gemaakt door het toxine streptolysine O is snel en afhankelijk van ^{Ca2 +} influx methodologie. Het testontwerp kan synchronisatie van de schade gebeurtenis en een nauwkeurige kinetische meting van het vermogen van cellen om plasmamembraan integriteit herstellen door beeldvorming en kwantificeren van de mate waarin de liphophilic kleurstof FM1-43 intracellulaire membranen bereikt. Deze live test ALSo kan een gevoelige beoordeling van het vermogen van exogeen oplosbare factoren zoals sphingomyelinase toegevoegd FM1-43 influx remt, die het vermogen van cellen om hun plasmamembraan herstellen. Deze test liet ons te tonen voor de eerste keer dat sphingomyelinase handelt stroomafwaarts van ^{Ca2 +-afhankelijke} exocytose, omdat extracellulaire toevoeging van het enzym bevordert opnieuw afdichten van de cellen permeabel in afwezigheid van ^{Ca2 +.}

Introduction

Het is bekend voor enkele tientallen jaren dat plasmamembraan herstel na mechanische letsel is een Ca ^{2 +-afhankelijk} proces ^1,2. Latere studies toonden aan dat ^{Ca2 +} influx door de wond veroorzaakt een krachtig proces van exocytose intracellulaire blaasjes op de plaats van letsel, die nodig is voor het opnieuw afdichten ^3,4. Het verlies van een fluorescente kleurstof in het cytoplasma van cellen opgeladen werd gebruikt om de snelheid van herstel beoordelen en concludeerde dat opnieuw afdichten is binnen <30 sec na verwonding ^5. Twee modellen werden in eerste instantie voorgesteld om de eis voor exocytose in plasmamembraan reparatie uit te leggen: 1) de "patch"-model, dat suggereerde dat Ca ^{2 +} influx door het letsel veroorzaakt aanvankelijk homotypische fusie van intracellulaire blaasjes, de vorming van een grote "patch" Dat zou vervolgens toegepast op het plasmamembraan naar de wond ⁶ en 2) de spanning verminderen model, dat dat membraan Adde voorgestelde sluitd door ^{Ca2 +-afhankelijke} exocytose in de nabijheid van de wond zou plasmamembraan spanning te verminderen, vergemakkelijken opnieuw afdichten van de bilaag ^7. De rol van ^{Ca2 +-geactiveerd} exocytose bij plasmamembraan reparatie werd verder versterkt door studies die aantonen dat lysosomen bevatten Ca ^{2 +} sensor molecule, synaptotagmin VII, waarin hun exocytose en plasmamembraan reparatie beschadigde cellen vergemakkelijkt ^8,9,10,11 .

Echter aanvullend bewijs aangegeven dat exocytose niet voldoende was om plasmamembraan kan herstellen. Naast mechanische tranen op het plasmamembraan, frequente vorm van celbeschadiging is permeabilisatie door poriënvormende toxinen geproduceerd door bacteriën ^12,13 of immuuncellen ^14,15. In tegenstelling tot mechanische tranen, porievormende eiwitten plaatst zichzelf op de plasmamembraan de vorming van een stabiele,-eiwit gevoerde porie die niet zomaar kunnen worden afgesloten door een membraan "patch" of door verminderinging membraan spanning. Intrigerend studies blijkt dat zoogdiercellen een efficiënt mechanisme om hun plasmamembraan herstellen na permeabilisatie met porie-vormende eiwitten, en dit proces vereist ook de aanwezigheid van extracellulair Ca ^{2 + 12.} Deze bevinding de vraag opgeworpen of transmembraan porie verwijdering uit het celoppervlak was ook een snel proces, zoals waargenomen met mechanische wonden ^5. Verrassenderwijs onze recente studies aangetoond dat het opnieuw afdichten van de cellen permeabel gemaakt met poriënvormende toxinen zeer vergelijkbare eigenschappen aan de reparatie van mechanische wonden: het proces vereist extracellulair Ca ^{2 +,} en is binnen ~ 30 sec. Onderzoeken deze werkwijze nader we onlangs vernomen dat naast Ca ^{2 +-gereguleerde} exocytose van lysosomen, plasmamembraan reparatie omvat een snelle vorm van endocytose, die wordt veroorzaakt door de afgifte van lysosomale enzym zure sphingomyelinase (ASM) en is essentieel niet alleen voor ee verwijdering van transmembraan poriën, maar ook voor het herstel van mechanische wonden ^16.

Om de kinetiek van cel nieuwe sluiting na permeabilisatie met porievormende eiwitten te bepalen, in ons laboratorium hebben we aangepast een live imaging methode die eerder had gebruikt om opnieuw afdichten van geïsoleerde-laser gewond spiervezels ¹⁷ beoordelen. Deze test is gebaseerd op eigenschappen van de lipofiele kleurstof FM1-43, die stabiel intercaleert in de buitenste laag van lipide bilagen verhoging in fluorescentie-intensiteit. Wanneer de plasmamembraan dubbellaag verstoord extracellulaire kleurstof toegang krijgt tot intracellulaire membranen, die een gevoelige test voor plasmamembraan letsel detecteren en repareren ^18,16,19,20. Om deze test te passen voor de beoordeling van de cel opnieuw sluiten na permeabilisatie met poriën vormende eiwitten, we pre-cellen geïncubeerd bij 4 ° C met bacteriële toxine streptolysine O (SLO), dat bindt aan cholesterol membraan ^21. Synchrone celpermeabilisatie kan vervolgens eenvoudig worden bereikt door het verplaatsen van de cellen van ijs verwarmen medium in een verwarmde microscoop fase die de oligomerisatie en verandering in conformatie die leidt tot de vorming van transmembraan porie activeert. Een voordeel van deze benadering op de eerder gepubliceerde tests met laser verwonding is dat een groter aantal cellen tegelijk kan worden geanalyseerd in een microscopisch veld, betere bemonstering van de celpopulatie. Gezien de overeenkomsten tussen de mechanistische cel nieuwe sluiting proces gezien na mechanische verwonding en permeabilisatie met porievormende toxinen, de test hier beschreven verschaft een zeer veelzijdige en krachtige werkwijze voor het ontleden van factoren betrokken bij het fundamentele proces van plasmamembraan reparatie. Als voorbeeld wordt aangetoond dat het mogelijk is om deze test te gebruiken om ^{Ca2 +} afhankelijke en onafhankelijke stappen van het reparatieproces te identificeren.

Protocol

1. Transcriptionele silencing van ASM Zaad 1,5 x 10 5 HeLa-cellen in 2 ml DMEM kweekmedium (DMEM hoog glucose met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 1% Penn-Strep) op 35 mm glazen bodem gerechten (MatTek) en incubeer overnacht bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator. Op de volgende dag, aspireren van de groei media en vervang deze door 2 ml DMEM gereduceerd serum medium (DMEM met 4% FBS), ten minste 1 uur voor het toevoegen van de siRNA transfectie mengsel. …

Representative Results

Lage concentraties van bacteriële sfingomyelinase (SM) redding plasmamembraan reparatie in cellen waaruit lysosomale zuur sfingomyelinase. De FM1-43 imaging test toonden eerder we cellen deficiënt voor het lysosomale enzym ASM en blootgesteld aan SLO verwonding in aanwezigheid van Ca2 + een plasmamembraan defect wordt gered door extracellulaire toevoeging van recombinant menselijk enzym 19. Aangezien de menselijke lysosomale ASM heeft een lage pH-optimum hebben we onderz…

Discussion

Eerdere studies op mechanische schade en plasmamembraan reparatie vertrouwd op diverse mechanismen van het verwonden van cellen, variërend van het laten vallen van glazen kralen, micropipetteren, scheren, krassen of schuren. Het uitlezen van al deze testen was kwalitatieve dan kwantitatieve, en heeft nauwkeurige informatie over de kinetiek van de reparatie-mechanisme niet geven. Het vermogen van cellen om hun plasmamembraan gesloten worden deze vormen van schade werd gemeten door de aanwezigheid of afwezigheid van trac…

Materials

			Reagent
HeLa 229 cell line	ATCC	CCL2-1
DMEM High Glucose	Invitrogen	11965
DMEM High Glucose No Calcium	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
Optimem Reduced Serum	Invitrogen	31985
Lipofectamine RNAiMax	Invitrogen	13778
Control medium GC content RNAi oligo	Invitrogen	12935300
SMPD1 RNAi oligo	Invitrogen	HSS143988
Fetal Bovine Serum Heat-inactivated	Gemini-Bioproducts	100-106
Sphingomyelinase from Bacillus cereus	Sigma	S7651
35 mm-glass bottom dishes	MatTek	P35G-0-14
			Material
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ti
Camera	Hamamatsu Photonics	C9100-50
Spinning disk confocal microscope	PerkinElmer	UltraViewVoX
Software analysis software	PerkinElmer	Volocity Suite
Environmental chamber	Pathology Devices	LiveCell System Chamber