Vivre Imaging test pour évaluer les rôles de Ca^{2 +} Et Sphingomyélinase dans la réparation des pores formant blessures à toxines

Summary

Imagerie en temps réel des cellules exposées au colorant lipophile FM1-43 permet une détermination précise de la cinétique par lequel les toxines formant des pores sont enlevés de la membrane plasmique. Il s'agit d'un test sensible qui peut être utilisée pour évaluer les exigences de Ca ^{2 +,} la sphingomyélinase, et d'autres facteurs de réparation de la membrane plasmatique.

Abstract

Blessures de la membrane plasmatique est un événement fréquent, et les plaies doivent être réparés rapidement pour assurer la survie cellulaire. Influx de Ca ^{2 +} est un événement de signalisation clé qui déclenche la réparation de plaies mécaniques de la membrane de plasma à l'intérieur ~ 30 sec. Des études récentes ont révélé que les cellules de mammifères reboucher aussi leur membrane plasmique après perméabilisation de formation de pores toxines dans un processus ^{2 +-dépendante} Ca implique que l'exocytose de la sphingomyélinase acide enzyme lysosomale suivie pores endocytose. Ici, nous décrivons la méthodologie utilisée pour démontrer que la refermeture de cellules perméabilisées par la toxine Streptolysine O est aussi rapide et dépend influx de ^{Ca2 +.} Le design de dosage permet la synchronisation de l'événement de blessure et une mesure cinétique précise de la capacité des cellules à restaurer l'intégrité de membrane plasmique par l'imagerie et la quantification de la mesure dans laquelle le colorant lipophile FM1-43 atteint les membranes intracellulaires. Ce concert als essaio sensible permet une évaluation de la capacité des facteurs solubles ajouté de manière exogène, tels que la sphingomyélinase pour inhiber l'influx FM1-43, ce qui reflète la capacité des cellules à réparer leur membrane plasmique. Ce test a permis de montrer pour la première fois que la sphingomyélinase agit en aval de Ca ^{2 +-dépendante} exocytose, puisque l'addition de l'enzyme extracellulaire favorise la refermeture de cellules perméabilisées en l'absence de Ca ^{2 +.}

Introduction

Il est connu depuis plusieurs décennies que la réparation de la membrane plasmatique après une lésion mécanique est un ^1,2 Ca ^{2 +} de procédé dépendantes. Des études ultérieures ont montré que l'influx de ^{Ca2 +} à travers la plaie déclenche un processus dynamique de l'exocytose de vésicules intracellulaires au niveau du site de lésion, qui est nécessaire pour resceller ^3,4. Le taux de perte d'un colorant fluorescent chargé dans le cytoplasme des cellules a été utilisé pour évaluer la vitesse de réparation, et a conclu que rescellement a été achevée à l'intérieur de <30 s après la lésion ^5. Deux modèles ont d'abord été proposés pour expliquer la nécessité d'exocytose dans la réparation de la membrane plasmique: 1) le modèle de «patch», ce qui suggère que influx de ^{Ca2 +} à travers la lésion déclenche fusion initialement homotypique des vésicules intracellulaires, formant un grand "patch" qui serait ensuite être appliquée sur la membrane plasmique de refermer la plaie ⁶ et 2) le modèle de réduction de la tension, qui a proposé que la membrane Added par Ca ^{2 +-dépendante} exocytose dans le voisinage de la blessure serait de réduire la tension de la membrane plasmatique, ce qui facilite refermeture de la double couche ^7. Le rôle de Ca ^{2 +} exocytose déclenchée dans le plasma réparation de la membrane a été renforcée par des études montrant que les lysosomes contiennent une molécule Ca ^{2 +} du capteur, synaptotagmine VII, ce qui facilite leur exocytose et plasma réparation de la membrane dans les cellules lésées ^8,9,10,11 .

Toutefois, une preuve supplémentaire a indiqué que l'exocytose seul n'était pas suffisant pour promouvoir plasma réparation de la membrane. En plus de larmes mécanique sur la membrane plasmique, une forme fréquente de lésion cellulaire est la perméabilisation par les toxines formant des pores produits par des bactéries ou des cellules immunitaires ^{12,13 14,15.} Contrairement aux déchirures mécaniques, des protéines formant des pores s'insèrent sur la membrane plasmique de formage, une protéine de pore bordée stable qui ne peut être refermé simplement en appliquant une membrane "patch" ou par réductionment la tension de la membrane. Curieusement, des études ont révélé que les cellules de mammifères possèdent un mécanisme efficace pour la réparation de leur membrane plasmique après perméabilisation avec des protéines formant des pores, ce procédé nécessite également la présence de Ca ^{2 +} extracellulaire ^12. Cette découverte a soulevé la question de savoir si le retrait transmembranaire des pores de la surface de la cellule a également été un processus rapide, comme on l'observe avec des blessures mécaniques ^5. De manière surprenante, les études récentes ont révélé que la refermeture de cellules perméabilisées avec des toxines formant des pores a des propriétés très similaires à la réparation des plaies mécaniques: le procédé nécessite le ^{Ca2 +} extracellulaire, et est achevée dans ~ 30 sec. Enquêter sur ce processus plus en détail, nous avons récemment appris que, en plus de Ca ² exocytose ⁺ réglementés des lysosomes, la réparation de la membrane plasmique implique une forme rapide de l'endocytose, qui est déclenchée par la libération de l'enzyme lysosomale sphingomyelinase acide (ASM) et est essentiel non seulement pour ee retrait de pores transmembranaires, mais également pour la réparation de plaies mécaniques ^16.

Pour déterminer la cinétique de la refermeture après perméabilisation des cellules avec des protéines formant des pores, dans notre laboratoire, nous avons adapté une méthodologie d'imagerie en temps réel qui a été utilisée précédemment pour évaluer refermeture de fibres musculaires isolées laser blessé ^17. Ce dosage repose sur les propriétés du colorant lipophile FM1-43, qui s'intercale de manière stable dans le feuillet externe de bicouches lipidiques augmentation de l'intensité de fluorescence. Lorsque le plasma membrane bicouche est perturbé gains de colorant extracellulaire accès à des membranes intracellulaires, en fournissant un dosage sensible pour détecter un dommage de la membrane plasmique et réparer ^18,16,19,20. Afin d'adapter ce test pour l'évaluation de la refermeture après perméabilisation des cellules avec des protéines formant des pores, on les cellules pré-incubées à 4 ° C avec la toxine bactérienne streptolysine O (SLO), qui se lie à la membrane ²¹ de cholestérol. Cellule synchroneperméabilisation peut alors être facilement réalisé en déplaçant les cellules à partir de la glace se réchauffer milieu dans une platine de microscope chauffée, ce qui active l'oligomérisation et le changement de conformation qui conduit à la formation de pores transmembranaires. Un avantage de cette approche, au cours des essais publiés précédemment à l'aide de la blessure au laser, est qu'un grand nombre de cellules peuvent être analysées simultanément dans un champ microscopique, offrant un meilleur échantillonnage de la population de cellules. Compte tenu des similitudes entre le processus mécanistes de refermeture de la cellule vu après une blessure mécanique et perméabilisation des toxines formant des pores, le test que nous décrivons ici fournit une méthode très puissante et polyvalente pour des facteurs impliqués dans le processus fondamental de plasma réparation de la membrane de dissection. A titre d'exemple, on montre qu'il est possible d'utiliser ce dosage pour identifier les mesures de ^{Ca2 +} dépendants et indépendants du processus de réparation.

Protocol

Une. Transcriptionnelle de l'ASM Graine de 1,5 x 10 5 cellules HeLa dans 2 ml de milieu de culture DMEM (DMEM riche en glucose avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM de L-glutamine, 1% de Penn-Strep) sur des plats de fond 35 mm en verre (MatTek) et incuber une nuit à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. Le jour suivant, aspirer hors des milieux de croissance et de la remplacer par 2 ml du milieu DMEM réduite de sérum (DMEM avec du FBS à 4%), au moins 1 heure av…

Representative Results

De faibles concentrations de bactéries sphingomyélinase (SM) sauvetage réparation de la membrane plasmatique dans des cellules appauvries en sphingomyélinase acide lysosomale. En utilisant le test de formation d'image FM1-43, nous avons précédemment montré que des cellules déficientes pour l'ASM enzyme lysosomale et exposés à SLO blessant en présence de Ca 2 + ont un défaut de la membrane plasmique est recueilli par addition extracellulaire de l'enzyme humaine…

Discussion

Des études antérieures sur blessure mécanique et la membrane plasmique réparation invoqués divers mécanismes de cellules blessant, allant de l'abandon des perles de verre, micropipetage, cisaillement, gratter ou racler. La lecture de tous ces essais était qualitative plutôt que quantitative, et ne donne pas d'informations précises sur la cinétique du mécanisme de réparation. La capacité des cellules à resceller leur membrane plasmique après ces formes de lésion a été mesurée en présence ou en…

Materials

			Reagent
HeLa 229 cell line	ATCC	CCL2-1
DMEM High Glucose	Invitrogen	11965
DMEM High Glucose No Calcium	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
Optimem Reduced Serum	Invitrogen	31985
Lipofectamine RNAiMax	Invitrogen	13778
Control medium GC content RNAi oligo	Invitrogen	12935300
SMPD1 RNAi oligo	Invitrogen	HSS143988
Fetal Bovine Serum Heat-inactivated	Gemini-Bioproducts	100-106
Sphingomyelinase from Bacillus cereus	Sigma	S7651
35 mm-glass bottom dishes	MatTek	P35G-0-14
			Material
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ti
Camera	Hamamatsu Photonics	C9100-50
Spinning disk confocal microscope	PerkinElmer	UltraViewVoX
Software analysis software	PerkinElmer	Volocity Suite
Environmental chamber	Pathology Devices	LiveCell System Chamber