Viva Imaging Ensayo para la evaluación de los Roles de Ca^{2 +} Y esfingomielinasa en la reparación de los poros de la formación de toxina Heridas

Summary

Formación de imágenes en vivo de las células expuestas a la colorante lipófilo FM1-43 permite la determinación precisa de la cinética por el cual las toxinas formadoras de poros son retirados de la membrana plasmática. Este es un ensayo sensible que puede ser utilizado para evaluar las necesidades del Ca ^{2 +,} esfingomielinasa y otros factores en la reparación de la membrana de plasma.

Abstract

Lesión de la membrana de plasma es un evento frecuente, y las heridas que ser reparado rápidamente para asegurar la supervivencia celular. La afluencia de Ca ^{2 +} es un evento de señalización clave que desencadena la reparación de heridas mecánicas en la membrana plasmática dentro de ~ 30 seg. Estudios recientes revelaron que las células de mamíferos también vuelven a sellar su membrana plasmática después de la permeabilización con formador de poros toxinas en un proceso de ^{2 +-dependiente} de Ca que implica la exocitosis de la esfingomielinasa ácida enzima lisosomal seguido por endocitosis de poro. Aquí se describe la metodología utilizada para demostrar que el resellado de las células permeabilizadas por la toxina estreptolisina O también es rápida y dependiente de Ca ^{2 +} afluencia. El diseño del ensayo permite la sincronización del evento lesión y una medición cinética precisa de la capacidad de las células para restaurar la integridad de la membrana de plasma mediante formación de imágenes y la cuantificación de la medida por la que el colorante liphophilic FM1-43 llega a las membranas intracelulares. Este vivo als ensayoO permite una evaluación sensible de la capacidad de exógenamente añadido factores solubles tales como la esfingomielinasa para inhibir FM1-43 afluencia, que refleja la capacidad de las células para reparar su membrana plasmática. Este ensayo nos permitió demostrar por primera vez que la esfingomielinasa actúa aguas abajo de Ca ^{2 +-dependiente} de la exocitosis, ya que la adición de la enzima extracelular promueve resellado de las células permeabilizadas en ausencia de Ca ^{2 +.}

Introduction

Se ha sabido durante varias décadas que reparación de la membrana de plasma después de la lesión mecánica es un ^1,2 Ca ^{2 +-dependiente} proceso. Estudios posteriores mostraron que el Ca ^{2 +} afluencia a través de la herida desencadena un proceso vigoroso de la exocitosis de las vesículas intracelulares en el sitio de la lesión, que se requiere para volver a sellar ^3,4. Se utilizó la tasa de pérdida de un colorante fluorescente cargado en el citoplasma de las células para evaluar la velocidad de la reparación, y llegó a la conclusión de que el resellado se completó dentro de <30 seg después de la lesión ^5. Dos modelos fueron propuestos inicialmente para explicar la necesidad de la exocitosis en la reparación de la membrana plasmática: 1) el modelo de "parche", lo que sugiere que el Ca ^{2 +} afluencia través de la lesión desencadena la fusión inicialmente homotípica de vesículas intracelulares, formando un "parche" de gran tamaño que haría a continuación, ser aplicada a la membrana plasmática para volver a sellar la herida ⁶ y 2) el modelo de reducción de la tensión, que propuso que la membrana Added por Ca ^{2 +-dependiente} de la exocitosis en las proximidades de la herida reduciría de plasma tensión de la membrana, facilitando de resellado de la bicapa de ^7. El papel de la Ca ^{2 +-desencadenó} la exocitosis en la reparación de la membrana plasmática se ve reforzada por estudios que muestran que los lisosomas contienen una molécula de Ca ^{2 +} sensor, sinaptotagmina VII, lo que facilita su exocitosis y reparación de la membrana plasmática de las células lesionadas ^8,9,10,11 .

Sin embargo, la evidencia adicional ha indicado que la exocitosis por sí sola no era suficiente para promover la reparación de la membrana de plasma. Además de lágrimas mecánicas en la membrana plasmática, una forma frecuente de lesión de las células es la permeabilización por las toxinas formadoras de poros producidos por bacterias o células inmunes ^{12,13 14,15.} A diferencia de las lágrimas mecánicas, proteínas formadoras de poros se insertan en la membrana plasmática que forma un poro estable, proteína forrado de que no se puede volver a cerrarse simplemente mediante la aplicación de un "parche" de la membrana o por reduccióning tensión de la membrana. Curiosamente, los estudios revelaron que las células de mamífero tienen un mecanismo eficiente para reparar su membrana plasmática después de la permeabilización con proteínas formadoras de poros, y este proceso también requiere la presencia de ^{Ca2 +} extracelular ^12. Este hallazgo plantea la cuestión de si la supresión de poro transmembrana de la superficie celular era también un proceso rápido, como se observa con heridas mecánicas ^5. Sorprendentemente, nuestros estudios recientes revelaron que el resellado de las células permeabilizadas con toxinas formadoras de poros tiene propiedades muy similares a la reparación de heridas mecánicas: el proceso requiere extracelular de Ca ^{2 +,} y se completa dentro de ~ 30 seg. La investigación de este proceso con más detalle, recientemente hemos aprendido que, además de Ca ^{2 +-exocitosis} regulada de los lisosomas, reparación de la membrana plasmática implica una forma rápida de la endocitosis, que se activa por la liberación de la enzima lisosomal esfingomielinasa ácida (ASM) y es esencial no sólo para the eliminación de poros transmembrana, sino también para la reparación de heridas mecánicas ^16.

Para determinar la cinética de resellado celular después de la permeabilización con proteínas formadoras de poros, en nuestro laboratorio hemos adaptado una metodología de formación de imágenes en vivo que se había utilizado previamente para evaluar el resellado de las fibras musculares aisladas de láser-heridos ^17. Este ensayo se basa en las propiedades del colorante lipófilo FM1-43, que se intercala de manera estable en el prospecto exterior de las bicapas de lípidos que aumentan en intensidad de fluorescencia. Cuando la membrana bicapa de plasma se interrumpe ganancias de tinte extracelular acceso a membranas intracelulares, proporcionando un ensayo sensible para detectar lesión de la membrana plasmática y reparar ^18,16,19,20. Para adaptar este ensayo para la evaluación de resellado celular después de la permeabilización con proteínas formadoras de poros, que las células pre-incubaron a 4 ° C con la toxina bacteriana estreptolisina O (SLO), que se une al colesterol de la membrana ^21. Celular síncronopermeabilización puede entonces lograrse fácilmente moviendo las células de hielo para calentar medio en una platina de microscopio calentado, que activa la oligomerización y cambio en la conformación que conduce a la formación de poros transmembrana. Una ventaja de este enfoque, en los ensayos previamente publicados utilizando heridas láser, es que un mayor número de células puede analizarse simultáneamente en un campo microscópico, proporcionando una mejor toma de muestras de la población celular. Dadas las similitudes mecánicas entre el proceso de resellado de células visto después de la lesión mecánica y la permeabilización con toxinas formadoras de poros, el ensayo como se describe aquí proporciona un método muy versátil y potente para factores implicados en el proceso fundamental de la reparación de la membrana de plasma de disección. Como un ejemplo, se muestra que es posible usar este ensayo para identificar los pasos de Ca ^{2 +} dependientes e independientes del proceso de reparación.

Protocol

1. Transcripcional silenciamiento de la ASM Semilla de 1,5 x 10 5 células HeLa en 2 ml de medio de crecimiento DMEM (DMEM alto en glucosa con 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM de L-glutamina, 1% de Penn-Strep) en platos inferior 35 mm de vidrio (MatTek) y incubar durante la noche a 37 ° C en el 5% de CO 2 incubadora. Al día siguiente, aspirado fuera de los medios de crecimiento y reemplazarlo con 2 ml de DMEM medio de suero reducido (DMEM con FBS al 4%), al menos 1 hora …

Representative Results

Las bajas concentraciones de reparación de la membrana plasmática esfingomielinasa (SM) de rescate de bacterias en las células agotadas en esfingomielinasa ácida lisosomal. Usando el ensayo de formación de imágenes FM1-43, que anteriormente mostró que las células deficientes para el ASM enzima lisosomal y expuestos a SLO hiriendo en la presencia de Ca 2 + tienen un defecto de membrana plasmática es rescatado por adición extracelular de la enzima humana recombinante 19….

Discussion

Los primeros estudios sobre el daño y la membrana plasmática de reparación mecánica se basó en diversos mecanismos de las células hiriendo, que van desde dejar caer bolas de cristal, micropipeteo, esquila, rayaduras o arañazos. La lectura de todos estos ensayos fue de tipo cualitativo más que cuantitativo, y no dio información precisa sobre la cinética del mecanismo de reparación. La capacidad de las células para volver a sellar su membrana plasmática después de estas formas de lesión se midió por la pre…

Materials

			Reagent
HeLa 229 cell line	ATCC	CCL2-1
DMEM High Glucose	Invitrogen	11965
DMEM High Glucose No Calcium	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
Optimem Reduced Serum	Invitrogen	31985
Lipofectamine RNAiMax	Invitrogen	13778
Control medium GC content RNAi oligo	Invitrogen	12935300
SMPD1 RNAi oligo	Invitrogen	HSS143988
Fetal Bovine Serum Heat-inactivated	Gemini-Bioproducts	100-106
Sphingomyelinase from Bacillus cereus	Sigma	S7651
35 mm-glass bottom dishes	MatTek	P35G-0-14
			Material
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ti
Camera	Hamamatsu Photonics	C9100-50
Spinning disk confocal microscope	PerkinElmer	UltraViewVoX
Software analysis software	PerkinElmer	Volocity Suite
Environmental chamber	Pathology Devices	LiveCell System Chamber