Lev Imaging Assay for at vurdere de roller Ca^{2 +} Og sphingomyelinase i reparation af poredannende Toxin Wounds

Summary

Levende billeddannelse af celler udsat for den lipofile farvestof FM1-43 muliggør en præcis bestemmelse af kinetikken, som poredannende toksiner er fjernet fra plasmamembranen. Det er et følsomt assay, der kan bruges til at vurdere kravene til Ca ^{2 +,} sphingomyelinase og andre faktorer på plasma membran reparation.

Abstract

Plasma membran skade er en hyppig begivenhed, og sår skal hurtigt repareret for at sikre cellulær overlevelse. Tilgangen af ^{Ca2 +} er en vigtig signalering hændelse, der udløser reparation af mekaniske sår på plasmamembranen i ~ 30 sek. Nylige undersøgelser har vist, at pattedyrceller også tillukkes deres plasmamembranen efter permeabilisering med poredannende toksiner i en ^{Ca2 +-afhængig} proces, der involverer exocytose af lysosomale enzym acid sphingomyelinase efterfulgt af pore endocytose. Her beskriver vi den metode, der anvendes til at påvise, at genlukning af celler permeabiliserede af giftstoffet streptolysin O er også hurtig og afhængig af Ca ^{2 +} tilstrømning. Assay design tillader synkronisering af skaden begivenhed og en præcis kinetisk måling af cellernes evne til at genoprette plasmamembran integritet ved billeddannelse og kvantificere det omfang, hvormed den liphophilic farvestof FM1-43 når intracellulære membraner. Denne levende assay also tillader en følsom vurdering af evnen af ​​eksogent tilsat opløselige faktorer såsom sphingomyelinase at inhibere FM1-43 tilstrømning, hvilket afspejler cellernes evne til at reparere deres plasmamembran. Dette assay tilladt os at vise for første gang, at sphingomyelinase virker nedstrøms for ^{Ca2 +-afhængig} exocytose, da ekstracellulær tilsætning af enzymet fremmer genlukning af cellerne permeabiliseret i fravær af ^{Ca2 +.}

Introduction

Det har været kendt i flere årtier, at plasmamembran reparation efter mekanisk skade er en ^{Ca2 +-afhængig} proces ^1,2. Senere undersøgelser viste, at ^{Ca2 +} indstrømning gennem såret udløser en kraftig proces exocytose af intracellulære vesikler på læsionsstedet, hvilket er påkrævet for genlukning ^3,4. Satsen for tab af et fluorescerende farvestof indlæst i cytoplasmaet i celler blev brugt til at vurdere hastigheden af reparation, og konkluderede, at genlukning blev afsluttet inden <30 sek efter skade ^5.. To modeller blev oprindeligt foreslået at forklare kravet om exocytose i plasmamembranen reparation: 1) "patch"-modellen, som foreslog, at ^{Ca2 +} tilstrømning gennem læsionen udløser oprindeligt homotypisk fusion af intracellulære vesikler, der udgør en stor "patch", der ville derefter anvendes på plasmamembranen at forsegle såret ⁶ og 2) spændinger reduktion model, som foreslog, at membran-Added af ^{Ca2 +-afhængig} exocytose i nærheden af såret vil reducere plasma membranspænding lette genlukning af dobbeltlaget ^7. Den rolle, Ca ^{2 +-udløst} exocytose i plasmamembranen reparation blev yderligere forstærket af undersøgelser, der viser, at lysosomer indeholder en Ca ^{2 +-sensor} molekyle, synaptotagmin VII, hvilket letter deres exocytose og plasma membran reparation i skadede celler ^8,9,10,11 .

Imidlertid har yderligere dokumentation tilkendegivet, at exocytose alene ikke var tilstrækkelig til at fremme plasmamembran reparation. Ud over mekaniske tårer på plasmamembranen, en hyppig form for cellebeskadigelse er permeabilisering af poredannende toksiner produceret af bakterier ^12,13 eller immunceller ^14,15. I modsætning til mekaniske tårer, poredannende proteiner indsætte sig på plasmamembranen danne en stabil, protein-foret porestørrelse, som ikke kan lukkes igen blot ved at anvende en membran "patch" eller ved reduktionning membranspænding. Interessant undersøgelser viste, at pattedyrceller har en effektiv mekanisme til at reparere deres plasmamembranen efter permeabilisering med pore-dannende proteiner, og denne proces kræver også tilstedeværelsen af ekstracellulær ^{Ca2 + 12.} Dette fund rejst spørgsmålet om, hvorvidt transmembrane pore fjernelse fra celleoverfladen var også en hurtig proces, som observeret med mekaniske sår ^5. Overraskende vores nylige undersøgelser viste, at genlukning af cellerne permeabiliseret med poredannende toksiner har meget lignende egenskaber til reparation af mekaniske sår: processen kræver ekstracellulær ^{Ca2 +} og er afsluttet inden for ~ 30 sek. Undersøgelse denne proces mere detaljeret, for nylig har vi lært, at ud over Ca ^{2 +-reguleret} exocytose af lysosomer plasmamembranen reparation medfører en hurtig form for endocytose, som udløses ved frigivelse af det lysosomale enzym acid sphingomyelinase (ASM) og er afgørende ikke kun for the fjernelse af transmembrane porer, men også til reparation af mekaniske sår ^16.

For at bestemme kinetikken af celle genlukning efter permeabilisering med pore-dannende proteiner i vores laboratorium vi tilpasset en levende billedbehandling metode, der var blevet brugt tidligere til at vurdere genlukning af laser-såret isolerede muskelfibre ^17. Dette assay er baseret på egenskaberne af den lipofile farvestof FM1-43, som stabilt interkalerer ind i det ydre blad af lipiddobbeltlag stigende i fluorescensintensitet. Når plasma membrandobbeltlaget er forstyrret ekstracellulære farvestof får adgang til intracellulære membraner, hvilket giver en følsom metode til påvisning af plasmamembranen skade og reparation ^18,16,19,20. At tilpasse dette assay til vurdering af celle genlukning efter permeabilisering med poredannende proteiner, vi præinkuberes celler ved 4 ° C med det bakterielle toksin streptolysin O (SLO), som binder til membran cholesterol ^21. Synkron cellepermeabilisering kan derefter let opnås ved at bevæge cellerne fra isen til at varme medium i en opvarmet mikroskopobjektbord, som aktiverer oligomerisering og ændring i konformation, som fører til transmembranprotein poredannelse. En fordel ved denne fremgangsmåde i de tidligere publicerede assays ved hjælp af laser sårdannelse, er, at et større antal celler kan analyseres samtidigt i en mikroskopisk felt, der giver bedre prøvetagning af cellepopulationen. I betragtning af de mekanistiske ligheder mellem cellen genlukning proces ses efter mekanisk skade og permeabilisering med poredannende toksiner assayet beskrevet her giver en meget alsidig og effektiv metode til at dissekere faktorer involveret i den grundlæggende proces med plasmamembranen reparation. Som et eksempel viser vi, at det er muligt at anvende dette assay til at identificere ^{Ca2 +} afhængige og uafhængige trin i reparationsprocessen.

Protocol

1.. Transcriptional undertrykkelse af ASM Seed 1,5 x 10 5 HeLa-celler i 2 ml DMEM vækstmedier (DMEM høj glucose med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 1% Penn-Strep) på 35 mm glasbund retter (Mattek) og inkuberes natten over ved 37 ° C i en 5% CO 2-inkubator. Den følgende dag, aspirat fra medierne vækst og erstatte det med 2 ml DMEM reduceret serum medium (DMEM med 4% FBS), mindst 1 time, før du tilføjer siRNA transfektion blanding. Forbered 4 r?…

Representative Results

Lave koncentrationer af bakteriel sphingomyelinase (SM) rednings plasmamembran reparation i celler udtømte i lysosomale syre sphingomyelinase. Brug FM1-43 imaging assay vi tidligere viste, at celler, der mangler for lysosomale enzym ASM og udsat for SLO sårdannelse i nærvær af Ca2 + har en plasmamembran defekt reddes af ekstracellulær tilsætning af det rekombinante humane enzym 19. Da den menneskelige lysosomale ASM har en lav pH-optimum, undersøgte vi, om genluknin…

Discussion

Tidligere undersøgelser af mekanisk skade og plasmamembranen reparation påberåbt sig forskellige mekanismer for at skade celler, der spænder fra slippe glasperler, micropipetting, klipning, ridser eller skrabning. Udlæsningen af ​​alle disse analyser var kvalitative snarere end kvantitative, og ikke give præcise oplysninger om kinetikken af ​​reparation mekanisme. Cellernes evne til at genforsegle deres plasmamembranen efter disse former for skade blev målt ved tilstedeværelse eller fravær af sporstoffe…

Materials

			Reagent
HeLa 229 cell line	ATCC	CCL2-1
DMEM High Glucose	Invitrogen	11965
DMEM High Glucose No Calcium	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
Optimem Reduced Serum	Invitrogen	31985
Lipofectamine RNAiMax	Invitrogen	13778
Control medium GC content RNAi oligo	Invitrogen	12935300
SMPD1 RNAi oligo	Invitrogen	HSS143988
Fetal Bovine Serum Heat-inactivated	Gemini-Bioproducts	100-106
Sphingomyelinase from Bacillus cereus	Sigma	S7651
35 mm-glass bottom dishes	MatTek	P35G-0-14
			Material
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ti
Camera	Hamamatsu Photonics	C9100-50
Spinning disk confocal microscope	PerkinElmer	UltraViewVoX
Software analysis software	PerkinElmer	Volocity Suite
Environmental chamber	Pathology Devices	LiveCell System Chamber