Live-Imaging-Assay für die Bewertung der Rollen von Ca^{2 +} Sphingomyelinase und in der Reparatur von Pore Toxin-bildenden Wunden

Summary

Echtzeit-Bildgebung von Zellen mit dem lipophilen Farbstoff FM1-43 ausgesetzt ermöglicht eine präzise Bestimmung der Kinetik durch die porenbildende Toxine sind von der Plasmamembran entfernt. Dies ist ein empfindlicher Test, der verwendet werden kann, um Anforderungen für die Ca ^{2 +,} Sphingomyelinase und anderen Faktoren auf die Plasmamembran Reparatur zu beurteilen.

Abstract

Plasma-Membran-Verletzung ist ein häufiges Ereignis, und Wunden müssen schnell repariert, um zelluläre Überleben zu gewährleisten. Einstrom von Ca ^{2 +} ist ein Schlüsselsignalisierungsereignis, das die Reparatur von mechanischen Verletzungen an der Plasmamembran innerhalb von ~ 30 s auslöst. Jüngste Studien zeigten, dass Säugerzellen ihrer Plasmamembran nach Permeabilisierung mit porenbildenden Toxinen in einem Ca ^{2 +-abhängigen} Prozess, der Exozytose des lysosomalen Enzyms saure Sphingomyelinase, gefolgt von Poren Endocytose beinhaltet auch wieder zu verschließen. Hier beschreiben wir die Methodik, um zu zeigen, dass das Wiederverschließen der Zellen durch das Toxin Streptolysin O permeabilisiert ist auch eine schnelle und abhängig von Ca ^{2 +-Einstrom.} Der Assay-Design ermöglicht die Synchronisation der Verletzungsanlaß und eine genaue kinetische Messung der Fähigkeit von Zellen, Plasmamembranintegrität von Abbildungs ​​wiederherzustellen und Quantifizieren des Ausmaßes, mit dem die lipophilen Farbstoff FM1-43 intrazellulären Membranen erreicht. Diese Live-Test ALSo ermöglicht eine sensible Bewertung der Fähigkeit von exogen zugesetzten löslichen Faktoren wie Sphingomyelinase FM1-43 Einstrom hemmen, was auf die Fähigkeit von Zellen, die Plasmamembran zu reparieren. Dieser Assay erlaubt uns zum ersten Mal zeigen, dass Sphingomyelinase wirkt abwärts von Ca ^{2 +-abhängigen} Exozytose, da extrazelluläre Zugabe des Enzyms fördert Wiederverschließen der Zellen in der Abwesenheit von Ca ^{2 +} durchlässig gemacht.

Introduction

Es ist seit mehreren Jahrzehnten bekannt, dass die Plasmamembran-Reparatur nach mechanischen Verletzungen ist ein Ca ^{2 +-abhängigen} Prozess ^1,2. Spätere Studien zeigten, dass Ca ^{2 +-Einstrom} durch die Wunde löst eine kräftige Prozess der Exozytose von intrazellulären Vesikeln an der Stelle der Verletzung, die zum Wiederverschließen ^3,4 erforderlich ist. Die Verlustrate der Fluoreszenzfarbstoff in das Zytoplasma der Zellen geladen wurde verwendet, um die Geschwindigkeit der Reparatur zu beurteilen und festgestellt, dass Wiederverschließen wurde innerhalb von <30 sec nach der Verletzung ⁵ abgeschlossen. Zwei Modelle wurden zunächst vorgeschlagen, die Voraussetzung für die Exozytose in Plasmamembran-Reparatur zu erklären: 1) die "Patch"-Modell, das vorgeschlagen, dass Ca ^{2 +-Einstrom} durch die Läsion löst zunächst homotypischen Fusion von intrazellulären Vesikeln, bilden eine große "Patch" Das wäre dann in die Plasmamembran aufgebracht, um die Wunde ⁶ und 2) die Spannungsreduzierung Modell, das die Membran adde vorgeschlagen werden verschließendurch Ca ^{2 +-abhängige} Exocytose in der Nähe der Wunde d würde Plasmamembranspannung zu verringern und erleichtert Wiederverschließen der Doppelschicht ^7. Die Rolle von Ca ^{2 +} ausgelöste Exocytose in der Plasmamembranreparatur wurde durch Studien, die zeigen, dass Lysosomen enthalten eine Ca ^{2 +-Sensormolekül,} synaptotagmin VII, die Exocytose und deren Plasmamembran Reparatur erleichtert verletzten Zellen verstärkt ^8,9,10,11 .

Allerdings hat zusätzliche Beweise zeigten, dass Exozytose allein war nicht ausreichend, um die Reparatur der Plasmamembran zu fördern. Neben mechanischen Tränen auf der Plasmamembran, ist eine häufige Form von Zellschädigung Permeabilisierung von durch Bakterien oder Immunzellen ^{12,13 14,15} hergestellt porenbildenden Toxinen. Im Gegensatz zu mechanischen Tränen, porenbildende Proteine, fügen sich auf der Plasmamembran, eine stabile, Protein-Pore gesäumt, die nicht einfach durch die Anwendung einer Membran "Patch" oder durch Reduktion wieder verschlossen werden könnenten Membranspannung. Interessanterweise Studien zeigten, dass Säugerzellen mit einem effektiven Mechanismus, um die Plasmamembran nach Permeabilisierung mit porenbildende Proteine ​​zu reparieren, und dieses Verfahren erfordert ebenfalls die Gegenwart von extrazellulärem Ca ^{2 + 12.} Dieser Befund warf die Frage auf, ob Transmembranporen Entfernung von der Zelloberfläche war auch ein schneller Prozess, wie bei mechanischen Wunden ⁵ beobachtet. Überraschenderweise zeigte unsere jüngste Studien, daß das Wiederverschließen der Zellen, die mit porenbildenden Toxinen permeabilisiert hat sehr ähnliche Eigenschaften wie die Reparatur von mechanischen Wunden: erfordert das Verfahren der extrazellulären Ca ^{2 +,} und wird innerhalb von ~ 30 sec abgeschlossen. Die Untersuchung dieses Prozesses näher wir vor kurzem erfahren, dass zusätzlich zu den Ca ^{2 +-regulierte} Exozytose von Lysosomen, Plasmamembran Reparatur beinhaltet eine schnelle Form der Endozytose, die durch die Freisetzung von lysosomalen Enzym ausgelöst wird, saure Sphingomyelinase (ASM) und ist essentiell nicht nur für the Entfernen der Transmembranporen, aber auch für die Reparatur von mechanischen Verletzungen ^16.

Um die Kinetik der Zellwiederverschließen nach Permeabilisierung mit porenbildenden Proteinen zu bestimmen, die wir in unserem Labor eine Echtzeit-Bildgebung geeignet Methodik, die zuvor verwendet worden war, um Wiederverschließen der Laser verletzt isolierte Muskelfasern ¹⁷ beurteilen. Dieser Assay beruht auf Eigenschaften der lipophilen Farbstoff FM1-43, die stabil interkaliert in die äußere Seite der Lipiddoppelschichten Erhöhung der Fluoreszenzintensität. Wenn der Plasmamembran-Doppelschicht extrazellulären Farbstoff erhält Zugang zu intrazellulären Membranen gestört, die ein empfindliches Assay Plasmamembran Verletzungen erkennen und reparieren ^18,16,19,20. Um diesen Test zur Beurteilung der Zellwiederverschließen nach Permeabilisierung mit porenbildende Proteine ​​anzupassen, wir vorinkubierten Zellen bei 4 ° C mit dem bakteriellen Toxin Streptolysin O (SLO), welche an Membrancholesterin ²¹ bindet. Synchron-ZellePermeabilisierung kann dann leicht durch Bewegen der Zellen vom Medium, um Eis in einem erwärmten Mikroskoptisch, der die Oligomerisation und Änderung der Konformation, die den Transmembranporenbildung führt aktiviert erwärmen erreicht werden. Ein Vorteil dieser Vorgehensweise gegenüber den bisher veröffentlichten Untersuchungen mit Laser Verwundung ist, dass eine größere Anzahl von Zellen gleichzeitig in einem mikroskopischen Feld analysiert werden, eine bessere Abtastung der Zellpopulation. Angesichts der Gemeinsamkeiten zwischen der Zellwiederverschließen Prozess nach mechanischen Verletzungen und Permeabilisierung mit porenbildende Toxine zu sehen ist, der Test beschreiben wir hier eine sehr vielseitige und leistungsstarke Methode zum Präparieren Faktoren in der grundlegenden Verfahren der Plasmamembran-Reparatur beteiligt. Als Beispiel zeigen wir, dass es möglich ist, diesen Test zu verwenden, um Ca ^{2 +-abhängigen} und unabhängigen Schritten des Reparaturvorgangs zu identifizieren.

Protocol

1. Transkriptions Silencing von ASM Samen 1,5 x 10 5 HeLa-Zellen in 2 ml DMEM Wachstumsmedium (DMEM mit hohem Glucose mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 1% Penn-Strep) auf 35 mm Glasbodenschalen (MatTek) und Inkubieren über Nacht bei 37 ° C in einem 5% CO 2-Inkubator. Am folgenden Tag, absaugen dem Wachstumsmedium und ersetzen Sie es mit 2 ml DMEM reduziert Serummedium (DMEM mit 4% FBS), mindestens 1 Stunde vor der Zugabe der siRNA-Transfektion Mischung. </l…

Representative Results

Niedrige Konzentrationen von bakteriellen Sphingomyelinase (SM) Rettungsplasmamembran-Reparatur in Zellen in lysosomalen sauren Sphingomyelinase erschöpft. Verwendung der FM1-43 Abbildungsassay wir früher gezeigt, dass Zellen defizient für das lysosomale Enzym ASM und SLO ausgesetzt Verwundung in Gegenwart von Ca 2 + über einen Plasmamembran-Defekt wird durch extrazelluläre Zugabe des rekombinanten menschlichen Enzyms 19 gerettet. Da das humane lysosomale ASM hat eine…

Discussion

Frühere Studien über mechanische Verletzungen und Plasmamembran Reparatur verließ sich auf vielfältige Mechanismen der Zellen zu verletzen, die von Fallenglasperlen, Mikropipettiervorrichtung, Scheren, Kratzen oder Schaben. Das Auslesen von all diesen Tests war eher qualitative als quantitative und hat genaue Informationen über die Kinetik der Reparaturmechanismus nicht geben. Die Fähigkeit von Zellen, die Plasmamembran nach dieser Formen von Verletzungen verschließen wurde durch die Anwesenheit oder Abwesenheit …

Materials

			Reagent
HeLa 229 cell line	ATCC	CCL2-1
DMEM High Glucose	Invitrogen	11965
DMEM High Glucose No Calcium	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
Optimem Reduced Serum	Invitrogen	31985
Lipofectamine RNAiMax	Invitrogen	13778
Control medium GC content RNAi oligo	Invitrogen	12935300
SMPD1 RNAi oligo	Invitrogen	HSS143988
Fetal Bovine Serum Heat-inactivated	Gemini-Bioproducts	100-106
Sphingomyelinase from Bacillus cereus	Sigma	S7651
35 mm-glass bottom dishes	MatTek	P35G-0-14
			Material
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ti
Camera	Hamamatsu Photonics	C9100-50
Spinning disk confocal microscope	PerkinElmer	UltraViewVoX
Software analysis software	PerkinElmer	Volocity Suite
Environmental chamber	Pathology Devices	LiveCell System Chamber